布鲁氏菌病（Brucellosis）（布病）是由布鲁氏菌 属（Brucella）侵入机体引起世界性、多宿主感染的人 兽共患病^[1]。贵州省分别于2010和2011年首次从患 病动物（山羊）和患者分离出羊种布鲁氏菌，从病原 学角度证实贵州省人和动物中存在布病感染^{[2, 3]}。本 研究以贵州省布鲁氏菌分离株为研究对象，采用布 鲁氏菌属外膜蛋白31基因PCR（BCSP31-PCR）和 基于插入序列IS711的牛、羊、绵羊附睾和猪种布鲁 氏菌特异的PCR（AMOS-PCR）技术鉴定其属和种 （型），应用基于16个可变数量串联重复序列（VNTR）的多位点可变数目重复序列分析（MLVA-16）技术分析贵州省人和动物来源布鲁氏 菌的分子流行特征。 材料与方法

1. 试剂：布鲁氏菌培养基采用进口布鲁氏菌肉 汤（批号为211088）和琼脂（批号为211086）成品培 养基（均购自美国BD公司），按照说明书配制。布 鲁氏菌阳性血清、单项特异性血清（A、M和R）、特异 噬菌体（Tb、BK-2、Wb、Fi）均由中国疾病预防控制 中心传染病预防控制所布病室提供。PCR引物由宝 生物工程（大连）有限公司合成。PCR相关试剂购于 宝生物工程（大连）有限公司。

2. 菌株：实验菌株为分离自贵州省2010－2012 年患者与动物（山羊）血液，并经传统方法鉴定为羊 种生物3型布鲁氏菌菌株（命名为ZY、ZA、SQ、LL3、 LL4和LL11），其中菌株ZY来源于铜仁市德江县患 者，菌株ZY和ZA来源于遵义市和正安县患者，SQ 来源于石阡县患者。LL3、LL4和LL11为黔南市龙 里县动物（山羊）疫情来源菌株。阳性对照菌株为布 鲁氏菌疫苗株A19（牛种）、M5（羊种）和S2（猪种） （购自兰州生物制品研究所有限责任公司）。

3. DNA提取：挑取布鲁氏菌可疑菌落接种于布 鲁氏菌琼脂平板，培养48h后采用水煮法提取细菌 核酸。 4. BCSP31-PCR法鉴定布鲁氏菌属：采用布鲁 氏菌属特异性基因BCSP31作为定属基因，按照文献 ^{[2, 3]}提供的B4和B5引物序列和参数进行布鲁氏 菌属的鉴定。

5. AMOS-PCR 法鉴定布鲁氏菌种/型：采用参考 文献^{[3, 4]}提供的以布鲁氏菌属IS711插入序列为 基础建立的AMOS-PCR引物及参数进行布鲁氏菌 种/型的鉴定。

6. MLVA-16分析：采用参考文献^{[5, 6]}提供的 方法进行，采用Bio-Numerics4.0软件将本次所测菌 株的MLVA-16各位点数据与文献报道^[5]的我国其 他省份的105株羊种布鲁氏菌菌株的MLVA-16数 据进行聚类分析。 结 果

1. BCSP31-PCR鉴定：BCSP31-PCR方法对分 离株和对照菌株核酸进行扩增，产物采用1.5%琼脂 糖电泳进行检测，结果显示，分离株及阳性对照菌株 核酸均扩增出布鲁氏菌属特异的223bp的条带，而 阴性对照无条带出现（图 1）。

注：M：相对分子质量标准；1：ZY株；2：ZA株；3：SQ株； 4：LL3株；5：LL4株；6：LL11株；7：疫苗株A19；8：疫苗株M5；9： 疫苗株S2；10：阴性对照图 1 贵州省羊种布鲁氏菌分离株BCSP31-PCR检测结果

图选项

2. AMSO-PCR检测：AMOS-PCR方法对分离株 和对照菌株核酸进行扩增，产物采用1.5%琼脂糖电 泳检测。结果显示，分离株及阳性对照菌株核酸均 扩增出羊种布鲁氏菌特异的731bp条带，而阴性对 照无条带出现（图 2）。

注：同图 1图 2 贵州省羊种布鲁氏菌分离株AMOS-PCR检测结果

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3. MLVA-16分 析：采 用MLVA-16的16个 VNTR位点引物序列对菌株核酸进行PCR扩增，然 后采用2.0%琼脂糖凝胶电泳均出现清晰条带，扩增 产物测序拼接后在测序序列上标记出引物序列的位 置并去除多余序列后获得各位点的序列长度，根据 重复单元长度计算出Bruce06、08、11、12、42、43、45、 55、04、07、09、16、18、19、21和30位点的重复数目 （图 3）。16个位点的重复数目显示，6株贵州省布鲁氏菌在VNTR位点Bruce06、08、11、12、43、45、55、18 和21上的重复数目完全相同，VNTR位点Bruce42、 04、07、09、16、19和30上存在重复数目差异（图 3）。 6株分离株中菌株ZY与ZA，菌株LL3、LL4和LL11 各位点的重复数目分别完全相同。6株菌与来自我 国其他省份的105株羊种布鲁氏菌被分为72个MT 型，其中菌株ZY和ZA为MT63型，菌株LL3、LL4 和LL11为MT67型，菌株SQ为MT72型（图 3）。将 各位点重复数目与来自我国其他省份105株羊种布 鲁氏菌的MLVA-16数据进行聚类分析，结果显示， 2010年分离自山羊的菌株LL3、LL4和LL11，ZY与 ZA分别聚类最近，相似性分别为100%。菌株SQ与 贵州省其余5株菌相对较远，相似性在60%左右。 贵州省分离菌株LL3、LL4和LL11，ZY与ZA与云 南、广东和福建省的羊种生物3型布鲁氏菌聚类较 近，菌株SQ与其他菌株聚类关系相对较远（图 3）。

注：图中边框标记内容为贵州省分离菌株信息图 3 贵州省羊种布鲁氏菌分离株与各省羊种布鲁氏菌MLVA-16聚类分析图

图选项

贵州省分别于2010和2011年首次从患病动物 （羊）和患者分离出羊种布鲁氏菌^{[2, 7]}，此后，布病疫 情在贵州省迅速扩散，散发和暴发疫情时有发生，因 此，布病属贵州省新发传染病。本研究将来源于贵 州省患者和动物的6株菌株采用属特异性 BCSP31-PCR和AMOS-PCR进行鉴定，结果显示本 次分离的可疑细菌为羊种布鲁氏菌。本研究中患者 均为农村地区的养羊户，均与羊有直接接触史，提示 羊为贵州省人间布病的主要传染源。

布鲁氏菌MLVA-16技术是基于16个VNTR位 点的分子分型方法，该技术已被应用于布鲁氏菌分 型并了解其遗传与分子流行病学特征^{[4, 5]}。本研究 中MLVA-16技术分析显示，来自贵州省的6株布鲁 氏菌分离株在部分VNTR位点（Bruce42、04、07、09、 16、19和30）存在重复数目差异，来自不同疫情患者 的3株菌中，遵义的ZY株和ZA株16个位点完全相 同，同属一个MLVA型（MT63），而SQ株在VNTR位 点Bruce04、09、19和30与ZY和ZA株具有重复数目 差别，被单独分为1个MLVA型（MT72），而3株来自 同一起动物疫情菌株LL3、LL4和LL11的16个位点 重复数目完全相同，同属一个MLVA型（MT67），提 示贵州省6株羊种生物3型布鲁氏菌基因组具有重 复序列多态性。MLVA-16所揭示的菌株间部分位 点存在重复数目差异可能为不同地域来源菌株之间 存在的遗传变异所致，其差异是否与布鲁氏菌的致 病力有关尚需要进一步研究。

聚类分析结果显示，本次分离菌株与我国羊种 生物3型布鲁氏菌聚类最近，提示6株布鲁氏菌为羊 种生物3型，这与全国布鲁氏菌病原体型别分布一 致^[8]。其中2010年分离自山羊的菌株LL3、LL4和 LL11，ZY与ZA分别聚类最近，相似性均为100%。 而菌株SQ与贵州省其余5株菌相对较远，相似性在 60%左右。此外，聚类图显示贵州省分离菌株LL3、 LL4、LL11、ZY和ZA与云南、广东和福建省的羊种 生物3型布鲁氏菌聚类较近，而菌株SQ与其他菌株 聚类关系相对较远，上述结果提示，贵州省布鲁氏菌 病病原体间的相似性和多样性及与我国其他省羊种 布鲁氏菌之间的遗传关系。经流行病学调查，本研 究中的患者均为养羊户，所饲养的羊多数为贵州省 因畜牧业发展需求而从外地引进羊或是来历不明的 山羊，提示贵州省动物间布鲁氏菌感染为输入性传 播，其云南、广东和福建可能为贵州省布病来源地， 抑或贵州省羊种布鲁氏菌流行株与云南、广东和福 建流行株属同一来源菌株。