广西壮族自治区（广西）扶绥县是我国原发性肝癌（肝癌）高发区，肝癌死亡率达55.62/10万，是全国平均水平的2倍^[1]。HBV感染、黄曲霉毒素B1摄入和饮用水源污染是当地肝癌发病的三大危险因素。通过实施防霉去毒、改水，黄曲霉毒素和饮用池塘水这两个致癌因素已得到较好控制，该地区肝癌有下降趋势，但肝癌发病率和死亡率仍然处在较高水平^[2]，提示HBV感染因素可能是当地目前肝癌高发的关键性因素。为此本研究采用病例对照研究设计，检测分析扶绥县肝癌患者和肝癌高危人群HBV基因型和BCP/前C区突变，为肝癌高发区HBV相关肝癌的病因学研究提供依据。 对象与方法

1. 研究对象：均来自本课题组于2003年起在广西扶绥县肝癌高发现场建立的高危人群队列，共123例，队列成员均为当地常住居民。其中肝癌病例组53例，对照组70例。肝癌病例的诊断符合2001 年中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》，对照组为HBV携带者。2008－2014年收集研究对象血清标本，分离后置-80 ℃冰箱保存备用。

2. 血清HBV DNA复制水平的检测：采用PCR-荧光探针法（乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒，湖南圣湘生物科技有限公司）检测HBV DNA水平，检测步骤参考试剂说明书，将50 μl血清样本与5 μl核酸释放剂充分混匀后作为PCR反应的模板，加入40 μl PCR-mix，2 000 r/min离心30 s后行PCR扩增。检测下限值为 500 copies/ml。

3. HBV DNA的提取和BCP/前C区扩增：取研究对象血清200 μl提取HBV DNA（天根PD315试剂盒），溶解于30 μl ddH2O中。采用巢式PCR扩增HBV BCP/前C区和S基因。BCP/前C区基因第一轮扩增引物为Fgp1和Rgp2，第二轮扩增引物为Fgp3和Rgp4（表 1）。BCP/前C PCR 第一轮反应条件为 95 ℃2 min；95 ℃ 35 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 10 min。第 一 轮 PCR扩增结束后，取 1 μl产物为模板，进行第二轮PCR 扩增，反应条件为 95 ℃ 2 min；95 ℃ 35 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 10 min。得到279 bp大小的产物。HBV S区第一轮扩增引物为Fgp5和Rgp6，第二轮扩增引物为Fgp7和Rgp8（表 1）。S区PCR第一轮反应条件为 95 ℃ 2 min； 95 ℃ 35 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 个循环；72 ℃ 10 min。第二轮反应条件为 95 ℃2 min；95 ℃ 35 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 个循环；72 ℃ 10 min。所有PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送北京六合华大基因科技股份有限公司（广州）进行 PCR产物纯化，并经 ABI3730xl 基因分析仪进行双向测序。

表 1 HBV S区、BCP/前C区巢式PCR扩增引物

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4. HBV 基因型的确定和突变点分析：应用Chromas软件读取测序峰图。根据S区序列，采用NCBI的在线病毒基因分型工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Projects/genotyping/formpage.cgi）确定HBV基因型。HBV 基因 BCP/前C区序列应用DNAMAN进行核苷酸变异分析。

5. 统计学分析：采用 SPSS 22.0软件进行数据统计分析。样本率的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法；正态分布计量资料均数以x±s表示，均数比较采用t 检验，偏态分布采用非参数秩和检验；所有检验均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。多因素分析采用非条件logistic回归分析，变量筛选用逐步后退法，纳入标准为P＜0.05，剔除标准为P＞0.1。 结果

1. 基本特征：病例组和对照组的性别、年龄、ALT分布的差异无统计学意义；病例组中有19例（35.8%）HBV DNA≥10⁵，低于对照组（38例，54.3%），差异有统计学意义（P＜0.05），见表 2。

表 2 两组研究对象基本特征

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2. HBV基因型分布：123例研究对象均为B和C两种基因型。其中B型占25.2%（31/123，病例组12例、对照组19例），C型占74.8%（92/123），提示广西扶绥肝癌高发区HBV基因型以C型为主。病例组和对照组中均以C基因型为主，分别为77.4%（41/53）和72.9%（51/70）。B和C基因型的分布在两组间的差异无统计学意义（χ2＝0.324，P＝0.569），提示基因型与肝癌的发生可能并无关联（OR＝1.273，95%CI：0.554～2.923）。

3. HBV BCP/前C区突变情况：以病例组HBV DNA为模板，巢式扩增BCP/前C区，经1%琼脂糖凝胶电泳，可见约300 bp的目的条带（图 1）。

图 1 BCP/前C区扩增电泳结果

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HBV基因点突变频率较高位点有BCP区A1762T/G1764A、T1753C、A1775G、C1799G，T1802C/T1803G/C1804T、前C区C1827A、A1846T、T1858C、G1896A、G1899A。其中A1762T/G1764A、T1858C突变在病例组中的突变率高于对照组，A1775G突变在病例组中的突变率低于对照组，差异有统计学意义，提示这3个位点的突变与肝癌发生相关（表 3）。前C区的C1827A在病例组和对照组中突变率均很高（98.1% vs. 94.3%），但差异无统计学意义。

表 3 HBV BCP/前C区主要突变位点的单因素分析

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4. HBV基因型和复制中各突变位点与肝癌发生的关系：在B基因型中A1762T/G1764A在病例组中的突变率高于对照组，提示B基因型A1762T/G1764A突变更易发生在肝癌患者中；C基因型中T1858C在病例组的突变率高于对照组，提示C基因型T1858C突变更易发生在肝癌患者中。无论是HBV DNA≥105组还是HBV DNA＜105组中，病例与对照间突变率的差异均无统计学意义（表 4）。

表 4 HBV基因型和复制水平中各突变位点与肝癌发生的关系

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5. A1762T/G1764A及其他因素与肝癌关系的多因素分析：利用非条件logistic回归二分类方法探讨与肝癌发生的相关因素。纳入因素包括性别、年龄、基因型以及A1762T/G1764A和T1858C、A1775G变异，其变量赋值见表 5。多因素logistic回归分析结果见表 6，显示A1762T/G1764A和T1858C、A1775G突变均与肝癌的发生有相关性。A1762T/G1764A和T1858C具有增加肝癌风险的趋势（OR＝5.459，95%CI：1.397～21.332，P＝0.015；OR＝3.881，95%CI：1.462～10.305，P＝0.006）。A1775G有降低肝癌风险的趋势（OR＝0.192，95%CI：0.059～0.622，P＝0.006）。HBV基因型和HBV DNA与肝癌的发生无相关性。

表 5 变量及其赋值

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表 6 A1762T/G1764A和T1858C与肝癌关系的多因素回归分析

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目前已鉴定发现HBV有10种基因型（A～J）和多种基因亚型，中国人以B、C型感染为主^[3]。本研究发现广西扶绥县肝癌高危人群感染的HBV基因型包括B型和C型，这两种基因型在肝癌病例组与对照组中分布的差异无统计学意义，提示基因型与当地肝癌的发生可能无直接关系，与广西肝癌高发家系和对照家系基因型的对比研究结果一致^[4]。Yang等^[5]认为C基因型相对B基因型更易增加肝癌的风险，可能与研究对象不同有关。Yang等^[5]的研究中HBV B基因型为主要流行株（64.2%），而本研究则以C基因型为主要流行株。HBV DNA 是 HBV 复制的指标，本研究显示对照组HBV DNA复制水平高于病例组，这是因为在HBV慢性感染发展为肝细胞癌的过程中，HBV基因整合到肝细胞基因组中造成病毒复制能力下降，外周血中 HBV DNA 拷贝数减少^[6]。

大量研究的结果提示A1762T/G1764A与肝癌的发生密切相关。2003 年我国台湾学者Kao等^[7]对250例慢性HBV（基因B或C型）患者A1762T/G1764A双联突变率进行分析，结果提示随着疾病严重程度增加，A1762T/G1764A双联突变率也相应增加；而且该双突变阳性率在肝癌患者中显著增高，是 HBV携带者发生肝癌的病毒学预测因素。2008年在江苏省启东市的一项研究对比了58例肝癌患者及与之匹配的71例慢性乙型肝炎患者发现，肝癌组BCP A1762T/G1764A双突变明显较对照组高，多因素logistic回归分析得出，BCP A1762T/G1764A变异与肝癌发生相关^[8]。Fang等^[9]在广西隆安地区的研究认为A1762T/G1764A双突变可以作为筛选男性HBsAg携带者肝癌最高危人群的生物学标记。本研究结果显示BCP区A1762T/G1764A双突变在病例组中的突变率高于对照组，差异有统计学意义，A1762T/G1764A双突变与肝癌发生的关系密切，是肝癌发生的危险因素，与上述研究结果一致 。但A1762T/G1764A双突变具体致癌机制尚未明确。有观点认为，BCP双突变可以上调pgRNA的转录，促进pgRNA衣壳化，增加HBcAg产量，从而增强 HBV 复制力。BCP区 A1762T/G1764A双突变引起编码蛋白质130 位亮氨酸（Leu）变为蛋氨酸（Met），131位从缬氨酸（Val）变为亮氨酸（Leu），使位于 BCP上的内核受体结合位点转为肝细胞核因子-1（HNF-1）的结合位点，由于转录因子结合的改变，使得前C区mRNA 的转录降低，最终导致HBeAg水平下降，pgRNA转录及HBcAg合成增强^[10]。由于上调核心蛋白的表达和下调前C蛋白的表达，从而加强衣壳化，导致病毒复制增加，导致HBV长期持续感染。此外，双突变正好位于p53结合区域，可能影响了p53的抑癌作用、DNA修复及调节细胞周期等功能。本研究病例组A1762T/G1764A突变率高达94.3%，实属少见，这与广西扶绥县持续的肝癌高发是否相关，有待进一步与低发区进行比较研究。本研究显示，B基因型中A1762T/G1764A在病例组中的突变率高于对照组，与Yang等^[5]的研究不一致，原因可能与本文B基因型样本量较少有关。

稳定的茎袢结构是病毒复制的基础，前C区是ε循环二级结构的一部分，其二级结构中，nt1896与nt1858的匹配程度决定了茎袢结构的稳定性。HBV基因型B、D、E及部分C型中，nt1858为T，通常认为nt1896的G突变为A可以使结构更加稳定，有利于病毒的复制和流行，因而PC变异常见于 B、C、D、E型。本研究与肝癌相关的位点是T1858C，而不是G1896A，与Sakamoto等^[11]的研究结果一致。由此推测，与nt1896的G突变为A的目的一样，nt1858 T 突变为C，也会使干拌结构趋向稳定，病毒的复制力增强，患肝癌的风险增加。来自香港地区的一项相关研究报道了在前C区nt1856～nt1858位点上3个碱基为TCC代表一种特定的HBV结构，与C基因型其他结构相比，TCC的模式会引起更为严重的肝脏疾病^[12]。

本研究发现一个与肝癌相关的新突变位点A1775G。相对于肝癌患者，A1775G突变更多见于慢性HBV感染者。提示较低的A1775G突变率可能为肝癌的保护性因素。对于C基因型或HBV DNA≥10⁵ copies/ml患者，对照组中A1775G突变率明显高于病例组。但关于A1775G突变的报道较少，一项在儿童中开展的研究表明A1775G突变与HBeAg血清学转化相关，HBeAg血清学转化儿童中A1775G突变率较高^[13]。另外两项研究中发现较高频率的A1775G突变，但是其在各疾病组中无统计学意义^{[14, 15]}。该位点突变对于肝癌的发病作用还需要进一步佐证。

为了综合分析肝癌的相关性因素，本研究将病例组和对照组所有相关因素包括年龄、性别、HBV DNA复制水平、HBeAg状态、基因型和病毒变异（A1762T/G1764A、T1858C、A1775G）进行logistic回归分析，结果显示年龄＞50岁、男性、A1762T/G1764A、T1858C、A1775G变异均与肝癌的发生有密切关系。本研究结果支持Yuen等^[16]的观点，认为BCP变异是肝癌的高危因素，基因型C与肝癌发生的密切关系是由于C基因型较易发生BCP变异所致。来自台湾地区的报道也表明只要有BCP变异，B、C基因型均有较高发生肝癌的危险性^[17]。

总之，在广西扶绥县肝癌高发区HBV基因型突变既有共同点，也有自身特点，相对其他地区人群A1762T/G1764A存在比较高的突变率实属少见，值得进一步探索。