登革热是广东省重点应对的虫媒病毒性疾病^[1]。2014年9月27日,深圳市龙岗区首次出现由本地登革热感染病例引起的暴发,本研究对疫情状况及其病原的分子流行病学特征进行研究。

1.材料与方法:

(1)流行病学调查:参照《登革热诊断标准》(WS 216-2008)对病例进行诊断,按照《登革热疫情现场调查处理规范(2006)》收集病例个案调查表及流行病学调查资料,采集病例急性期血清进行登革病毒(DENV)抗体IgM (试剂为中山生物工程有限公司产品)和DENV-1~4型病毒核酸检测(试剂为上海之江生物科技有限公司产品),并开展媒介调查。

(2)病毒分离与滴度测定:血清接种至单层C6/36细胞中,置于28℃、5% CO₂培养箱培养7 d,出现细胞病变(CPE)为阳性,连续盲传3代仍无CPE为阴性。将C6/36细胞传代至96孔板中,取分离成功的病毒悬液用维持液连续稀释8个滴度至10^-8,每稀释度接种4孔,每孔100 μl,并设对照孔,37℃,5% CO₂培养96 h后逐日观察CPE,按照Reed-Muench法计算50%组织细胞病毒感染量(TCID50)。

(3) RT-PCR扩增:选用日本TaKaRa公司的Prime Script RT-PCR试剂盒进行RT-PCR,参照说明书,利用Random 6 mers为引物制备cDNA,取4 μ l为模板,以DV-816F (CTC TGA GAC ACC CAG GAT TCA C)和DV-2598R (GCT GAT CGAATT CCA CAC AC)为引物,扩增DENV的E区段基因(1 782 bp),反应结束后,2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段,预测大小为1 782 bp,测序由英潍捷基(上海)公司完成。

(4)序列测定与分析:应用BioEdit软件对测序结果进行拼接,以DNAstar软件中的MegAlign插件和Mage 4.1软件分别进行同源性分析并构建系统进化树(邻接法)。

2.结果:

(1)疫情概况:2014年9月27日至10月2日,龙岗区某工地共确诊DENV-1型感染病例7例(SZ2014LG01~07),均为男性,无外出史,至10月11日未出现新增病例。

首例确诊病例(SZ2014LG01)为工程师,9月21日发热、头痛、乏力,就医未见好转,27日检出DENV核酸及抗体IgM。9月29日至10月2日对工地在职员工174人进行排查,共确诊4例病例(SZ2014LG02~SZ2014LG05),均为建筑工人。SZ2014LG04于9月6日发病,为最早出现临床症状的首发病例,未进行治疗继续工作,29日血清学检测IgM为阳性后隔离治疗。对9月27日前离职员工进行追踪,分别在南山区和罗湖区发现2例病例(SZ2014LG06、SZ2014LG07),离职前一直为该工地建筑工人,SZ2014LG06于18日离开龙岗前往南山工作,22日出现发热症状,28日确诊为登革热;SZ2014LG07于25日离开工地,27日出现临床症状,10月1日确诊。

(2)媒介监测结果:建材堆放处与在建楼盘地下车库的排水明渠是主要的蚊虫孳生地。9月27日(疫点消毒和杀菌)、30日和10月3、6日,对工地及周边小区进行伊蚊幼虫监测,布雷图指数分别为8.6、6.8、4.5、3.2。

(3)病毒分离与滴度:血清样本用C6/36细胞进行病毒分离,2份(SZ2014LG01、04)成功分离出病毒,分别在第一代4 d和3 d出现CPE,TCID50分别为10^-5.3/0.1 ml和10^-6.8/0.1 ml。

(4) E基因序列分析:采用RT-PCR对确诊患者血清进行DENV核酸检测,4份(SZ2014LG01、SZ2014LG02、SZ2014LG04、SZ2014LG05)获得E区基因核苷酸序列,BioEdit软件拼接整理后长度为1 485 bp,核苷酸序列相似性为100.0%,未发现碱基缺失和插入。首例确诊病例SZ2014LG01与国内外不同时期的DENV-1型代表株进行同源性比对(表 1),核苷酸同源性为90.8%~99.6%,推导氨基酸为96.2%~100.0%,与东莞市分离株D13459/Donguang/2013的同源性最高(核苷酸:99.6%,氨基酸:100.0%)。SZ2014LG01的E基因推导氨基酸序列与DENV-1型代表株相似,含有2个糖基化位点,分别位于第67~69位(NTT)和153~155位(NET),其中3个毒力位点^[2]E44(E)、E156(T)和E366(N)均无改变。根据Goncalvez等^[3]对DENV-1的分型原则,构建龙岗分离株(SZ2014LG01)与5个基因型代表株的系统进化树(图 1),龙岗株SZ2014LG01与东莞市分离株D13459/Donguang属同一个进化分支(Ⅴ型)。

表 1 深圳市龙岗区DENV-1型SZ2014LG01株与国内外部分毒株E基因同源性比较

表选项

图 1 深圳市龙岗区DENV-1型病毒SZ2014LG01株E基因系统进化树

图选项

3.讨论:本起疫情的病例分布具有明显聚集性,患者以建筑工人为主(85.7%),查阅本街道未发现其他本地或输入性病例;疫情持续时间较短(26 d),呈现单峰流行趋势,9月6日首发病例出现后,在22、23、27日出现1个发病高峰(4例),29日起迅速对患者进行隔离治疗,并筛查密切接触者,对疫点进行消毒、杀菌和灭蚊,10月1日出现2例新增患者后未出现二代病例;9月6-27日该地区午间室外温度为(30± 4)℃,工地工人(包括患者SZ2014LG02~07)习惯在阴凉潮湿的地下车库午休并反映有蚊虫叮咬经历,而车库内明渠存在严重幼蚊孳生情况,提示地下车库是重要的暴露因素,初步判断此为本地感染病例引起的聚集性登革热暴发疫情。1985-2007年,深圳市出现的登革热病例以输入性为主,未出现本地感染病例^[4],2010年才首次出现由本地感染病例引起的登革热暴发^[5],病原为DENV-1。与其相似,本次疫情7例登革热病例均由DENV-1引起,提示深圳市本地感染的优势型可能为DENV-1型。

1985-2010年,广东DENV-1流行株以基因Ⅰ型为主(1997、1999、2003),Ⅳ型(1991、1995)和Ⅴ型(1985、2006)交替出现^[1];本研究进化树分析显示,2010年深圳本地流行株(D10102-SZ)与2013年广州流行株(GZ28/2013,GZ/25559/2013)为DENV-1基因Ⅰ型,而本疫情病原均为基因Ⅴ型,与2013年东莞市分离株D13459/Donguang属同一进化分支,提示2010年后广东地区DENV-1的基因型流行趋势未见明显改变。同源性分析显示,龙岗株SZ2014LG01与东莞株D13459/Donguang同源性最高,而两地地理相邻,人流物流频繁,不排除本疫情的病原源自东莞市。