致泻性大肠埃希菌（DEC）感染可致婴幼儿和成年人急/慢性腹泻，严重者甚至并发溶血性尿毒综合征（HUS）^[1]。DEC感染不仅散发存在，还经常引起大规模食源性疾病暴发，对公共卫生造成严重威胁^[2]。DEC根据毒力特征主要分为5种型别：肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）、肠出血性大肠埃希菌（EHEC）、肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）和肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）^[3]。目前DEC实验室检测方法仍显复杂，我国关于DEC感染的数据较为有限。为此本研究依托深圳市感染性腹泻病原谱监测网络，在4家哨点医院腹泻患者中开展DEC分离、鉴定、血清分群及PFGE分型分析。

1. 标本来源：选择深圳市4家（市、区级各1家及街道级2家）综合性医院作为哨点医院。2014年每个哨点医院每月采集门诊急性期感染性腹泻患者新鲜粪便标本30～60份（采样率为3%～7%）。监测病例纳入标准为每日排便≥3次，粪便性状改变呈稀便、水样便、黏液便或脓血便等；排除已使用抗生素的患者，不恰当服用化学物质或食用毒蕈等致腹泻患者，以及明确诊断为阿米巴痢疾等寄生虫性腹泻和腹泻超过2周的病例。

2. 主要试剂和仪器：科玛嘉ECC显色平板（郑州博赛生物技术公司），大肠埃希菌诊断血清（日本生研株式会社），PCR引物、探针及相关试剂[宝生物（大连）有限公司]，Seakem Gold Agarose （Lonza公司，美国），蛋白酶K、EDTA[Sigama（上海）试剂有限公司]，XbaⅠ 酶（NEB公司，美国），Gel Red（Biotium公司，美国），荧光PCR仪CFX 96、CHEF-DR Ⅲ电泳仪和成像系统（Bio-Rad公司，美国），Bionumerics 软件（Version No. 6.0； Applied Maths，比利时）。

3. 菌株分离和分子鉴定：将采集的新鲜粪便标本接种ECC显色平板，（36±1） ℃培养18～24 h后，随机挑取3个蓝色菌落接种克氏双糖铁斜面培养基，在相同温度再培养18～24 h，生化反应符合大肠埃希菌的培养物用于DEC的分子鉴定及血清分型。采用水煮法提取模板DNA ，刮取新鲜培养物悬浮于加有200 μl灭菌水的EP管中，水浴煮沸5 min后，8 000 r/min离心10 min，取上清液备用。利用本实验室建立的改良分子信标多重荧光PCR 2管法鉴定DEC^[4]。ETEC的目标基因为stp、sth和lt，EPEC为eaeA、escV，EHEC为eaeA、escV、stx1和stx2，EAEC为aggR，EIEC为ipaH。引物、探针序列及反应体系见陈清亮等^[4]报道。检测样本Ct值＜35，且有标准的“S”形曲线者诊断为阳性。

4. 血清分群和PFGE分析：用大肠埃希菌O抗原诊断血清52种，根据产品使用说明，对分子鉴定为DEC的菌株进行O抗原分群。按照PulseNet Intenational“大肠埃希菌（O157 ∶ H7和非O157）、沙门菌、宋内志贺菌和福氏志贺菌PFGE标准操作程序”操作，选用XbaⅠ酶，电泳时间为19 h。电泳结束后，将凝胶放入3×Gel Red 染液中染色 30 min；去离子水洗脱2次，每次30 min。Bio-Rad成像分析系统拍照。用BioNumerics软件对电泳图谱进行数据分析。

1. DEC分离率及感染人群特征：2014年深圳市4家哨点医院腹泻就诊人数为46 487例，其中急性腹泻1 823例，采样率为3.92%。共分离到基因阳性DEC 74株，阳性分离率为4.06%，未发现与其他致病菌的混合感染。DEC感染者以男性为主（60.8%），暂住人口居多（48.6%）；年龄分布以＜3岁的婴幼儿（31.1%）及20～39岁中青年（45.9%）为主；患者中约半数仅有腹泻症状，36.5%伴腹痛，出现发热/呕吐者不足20%，64.9%表现为水样便。不同特征患者DEC分离率有差异，但均无统计学意义（表1）。DEC腹泻病例集中在5－9月夏秋季，以6月病例数最多（14例）；阳性率呈现2个高峰，分别为6月（7.41%）和9月（7.69%）。

表 1 2014年深圳市DEC感染者的人口学及症状特征

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2. 菌株型和血清群：74株DEC以ETEC最多（34株，45.9%），其次为EPEC（23株，31.1%）和EAEC（16株，21.6%），EIEC仅1株，未检测到EHEC菌株。有57株菌 O抗原均获得分型，包括全部34株ETEC、12株EPEC和1株EIEC；27株菌O抗原不能分型，包括全部16株EAEC和11株EPEC。34株ETEC菌株分为9个血清群，以O159最多（13株），其次为O148（5株）和O25（4株）；12株EPEC的O抗原比较分散，有11种（表2）。不同年龄组DEC分离率有差异，＜3岁和≥60岁年龄组DEC分离率较高，以感染EPEC和EAEC为主；20～、40～岁年龄组ETEC分离率相对较高（2.34%和2.42%）（表3）。

表 2 2014年深圳市74株DEC型别和血清群分布

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表 3 2014年深圳市不同年龄组腹泻病例DEC分离情况

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3. PFGE聚类分析：图1可见深圳地区DEC呈现分子型别的多态性。EPEC和EAEC未发现带型一致的菌株。同一血清群ETEC的PFGE带型存在一定相似性，聚集在一同分支。ETEC条带型一致的菌株有5簇，包括O148、O25菌株各1簇和O159菌株3簇。成簇病例发病时间跨度在1个月内的有3簇，包括O148、O25和O159菌株各1簇，其中O159成簇的2名病例居住地相聚较远，O148和O25成簇病例居住在相邻街道，提示有可能存在关联。

图 1 2014年深圳市哨点医院腹泻患者分离的EPEC、 EAEC/EIEC和ETEC的PFGE聚类分析

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国内外普遍采用PCR法检测毒力基因来鉴定DEC^{[5, 6, 7, 8, 9]}。本实验室开发的2管多重荧光PCR法检测5种DEC，具有灵敏、准确、简便、快速等特点^[4]，为DEC的大样本检测和常规监测提供了技术保障。

2014年深圳市4家哨点医院门诊急性腹泻病例DEC的分离率为4.06%，在细菌性腹泻中仅次于沙门菌。与国内其他地区相比，深圳市DEC检出率与北京市（4.0%）相近，但低于河南（9.2%）、浙江（14.1%）省和上海市（17.7%）^{[6, 7, 8, 9]}。研究显示，不同国家、地区间DEC分离率有差异，如在巴西腹泻儿童中甚至高达59%^[5]。本研究表明选择腹泻伴发热、腹泻伴发热及腹痛、腹泻伴呕吐及腹痛、水样便的患者采样，有助于提高DEC的检出率；从选择性平板上挑取更多的菌落进行基因检测也可提高DEC的检出率，但工作量较大。

不同地区DEC的型别存在一定差异，深圳市DEC以ETEC为主（45.9%），其次为EPEC（31.1%）。上海市徐汇区DEC感染者中ETEC约占半数（65/148），与本研究相似；北京市感染中EPEC最多为42.8%；浙江和河南省则以EAEC和EPEC为主；EIEC和EHEC在国内各地仅有零星检出^{[6, 7, 8, 9]}。

DEC感染存在年龄分布特征。深圳市＜3岁婴幼儿和≥60岁老年人DEC阳性率较高，以EPEC和EAEC为主；ETEC主要感染成年人。北京、上海市监测数据显示成年人组DEC检出率最高^{[6, 8]}。ETEC主要感染成年人与通常认为的ETEC主要感染婴幼儿和旅行者不同，其原因有待进一步分析。

DEC表型和基因型存在多样性，深圳市超过1/3的菌株不能分到血清群；分到血清群的菌株中仅以ETEC中的O159较多，O148和O25血清群菌株略多。北京市分离的DEC也表现出血清型复杂分散性^[6]。本研究显示深圳市EPEC、EAEC和EIEC菌株PFGE带型均很分散，未发现条带型一致的菌株。ETEC的PFGE结果显示有5簇聚类，其中2簇的两两病例发病时间相隔在1个月内，居住地址为相邻街道，提示有可能存在关联。

综上所述，DEC是造成深圳市人群感染性腹泻的一组重要病原菌，2014年在细菌性腹泻病原中的分离率仅次于沙门菌，以ETEC和EPEC为主，血清群和PFGE型均较分散，ETEC存在一定暴发风险，需加强关注。