诺如病毒包括GⅠ、GⅡ型，是导致各年龄组人群急性胃肠炎暴发和散在流行的主要病原^{[1, 2, 3]}。研究表明，诺如病毒通常导致轻微和自限性疾病，典型临床表现为急性腹泻、发热和呕吐等症状，严重者可导致死亡^{[4, 5]}。诺如病毒具有高度变异性，持续监测急性胃肠炎患者中诺如病毒的分子流行病学特征有助于诺如病毒感染的预防和控制。本研究对杭州地区急性胃肠炎门诊患者中诺如病毒的分子流行病学特征进行分析。

1. 临床样本收集：2014年3月至2015年4月采集浙江大学医学院附属第一医院和杭州市清波街道社区卫生服务中心门诊就诊的1 109例急性胃肠炎患者的粪便样本和临床资料，患者就诊前均未使用过抗生素。样本于-80 ℃保存备用。

2. 病毒核酸提取：用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）将每份粪便样本稀释制备成10%的悬液，7 104×g离心后吸取140 μl上清液，利用德国Qiagen公司QIAamp Viral RNA Mini试剂盒提取病毒核酸。严格按试剂盒操作说明书进行，收集终体积为50 μl的RNA提取液，采用NanoDropND-2000核酸检测仪器检测RNA纯度和浓度，-80 ℃保存备用。

3. 病毒初筛：应用上海辉睿生物科技有限公司生产的诺如病毒GⅠ/GⅡ型分型 RNA检测试剂盒（荧光RT-PCR法）（货号：VR-Ⅱ-202） 对临床样本进行诺如病毒GⅠ、GⅡ型初筛，所用PCR仪器为ABI7500。反应体系：诺如病毒GⅠ/GⅡ反应液15 μl，酶混合液5 μl，待测样本RNA 5 μl，总体积25 μl；扩增条件：50 ℃反转录30 min，95 ℃预变性5 min，40个循环（95 ℃变性10 s，55 ℃退火、延伸及荧光检测共45 s），检测通道：FAM（GⅠ），VIC（GⅡ）。结果判断：在阴/阳性对照及扩增曲线均良好的情况下，Ct值＜35为阳性；Ct值≥38或0为阴性；35≤Ct值＜38为疑似，重复测定，Ct值≥38为阴性；Ct值＜38为阳性。

4. 多重PCR检测：应用大连宝生物公司的TaKaRa PrimeScript^TM Ⅱ 1^st strand cDNA Synthesis试剂盒（Cat#6210A），将诺如病毒初筛为阳性的RNA反转录为cDNA。反应条件：42 ℃反转录20 min，99 ℃灭活反转录酶5 s，4 ℃保存备用，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。将上述反转录产物cDNA作为模板，对诺如病毒GⅠ、GⅡ型进行双重PCR扩增。扩增引物参照文献[2]。反应体系：25 μl：2.5 μl的10×ExTaq缓冲液，2.0 μl的2.5 μmol/L dNTPs，0.5 μl的10 μmol/L混合引物（GI-SKF，GI-SKR；CoG2F，G2SKR），0.25 μl的ExTaq酶（5 U/μl），2 μl的cDNA模板，其余用去离子水补足。扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；70 ℃ 7 min，4 ℃终止反应。PCR产物应用2%琼脂糖凝胶进行电泳、显色、分析。

5. 序列分析和系统进化树构建：随机选择电泳阳性的PCR产物送杭州博尚生物技术有限公司进行测序。其测序结果采用DNAMAN 5.1软件进行比对，并利用Mega 4.0软件绘制进化树，所有诺如病毒GⅠ、GⅡ型参考株均来源于GenBank数据库。

6. 统计学分析：采用SPSS 13.0软件，对年龄、季节分布等资料进行 χ²检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

1. 诺如病毒检出率：在1 109份急性胃肠炎患者的粪便样本中，诺如病毒检出率为 26.87%（298/1 109），其中GⅠ亚型为1.35%（15/1 109），GⅡ基因亚型为25.52%（283/1 109）。男性患者诺如病毒的阳性率为27.53%（158/574），其中GⅠ和GⅡ亚型分别为1.39%和26.13%；女性患者诺如病毒的阳性率为26.17%（140/535），其中GⅠ和GⅡ亚型分别为1.31%和24.86%。不同年龄组中，以≥18岁组的诺如病毒检出率较高，为33.87%（190/561），其中GⅠ和GⅡ亚型分别为1.60%（9/561）和32.26%（181/561）；以＜5岁年龄组中的诺如病毒检出率最低，为18.03%（33/183），其中GⅠ和GⅡ亚型分别为1.09%（2/183）和16.94%（31/183），见表 1。

表 1 2014-2015年杭州地区急性胃肠炎患者中诺如病毒的检测

表选项

2. 诺如病毒的季节分布：诺如病毒引起的急性胃肠炎全年均可发生，以12月至次年3月为高发季节，高峰期的阳性率为29.67%～37.08%，最高峰发生在2月。诺如病毒GⅡ型的分布趋势与诺如病毒基本一致，而诺如病毒GⅠ型的季节分布无明显变化趋势，见表 2。

表 2 2014-2015年杭州地区急性胃肠炎患者中诺如病毒的季节分布

表选项

3. 诺如病毒进化分析：随机选择9株诺如病毒GⅠ型、28株诺如病毒GⅡ型阳性PCR产物进行测序和系统进化分析（图 1）。结果显示，诺如病毒GⅠ型：5株为诺如病毒GⅠ-1型，与M87661/NVUSA93/GⅠ-1株的核苷酸同源性为91.8%～92.5%；2株为诺如病毒GⅠ-2型，与L07418/SOVGBR93/GⅠ-2株的核苷酸同源性为97.3%～98.0%；1株为诺如病毒GⅠ-4型，与AB042808/ChibaJPN00/GⅠ-4株的核苷酸同源性为89.8%；1株为诺如病毒GⅠ-5型，与AB039774/SzUG1JPN/GⅠ- 5株的核苷酸同源性为95.2%。诺如病毒GⅡ型：13株为诺如病毒GⅡ- 4型，与JX459908/Sydney/NSW0514/2012/AU GⅡ- 4株的核苷酸同源性为91.8%～92.5%；7株也为诺如病毒GⅡ-4型，与AB291542/Kobe034/2006b/JP/GⅡ-4株的核苷酸同源性为97.3%～98.0%；4株为诺如病毒GⅡ-6型，与AB039776/Saitama U3/GⅡ- 6株的核苷酸同源性为95.2%；3株为诺如病毒GⅡ-3型，与U22498/MX/GⅡ-3株的核苷酸同源性为95.2%；1株为诺如病毒 GⅡ-13型，与AB078334 KSW47JPN GⅡ-13株的核苷酸同源性为89.8%，见图 2。

图 1 诺如病毒GⅠ病毒衣壳蛋白N/S区系统进化树

图选项

图 2 诺如病毒GⅡ病毒衣壳蛋白N/S区系统进化树

图选项

急性胃肠炎是人类最常见的传染病之一，在发展中国家和发达国家造成较高的发病率和死亡率^{[5, 6, 7]}，病毒感染在所有急性胃肠炎原因中占50%以上^{[8, 9]}。A组轮状病毒、诺如病毒、札幌病毒、星状病毒和肠道腺病毒是病毒性急性胃肠炎腹泻的主要病原^{[2, 10, 11]}。诺如病毒是公认的全世界所有年龄组人群急性病毒性胃肠炎散在病例和暴发的主要原因^{[6, 12]}。本研究显示，门诊采集的急性胃肠炎患者的粪便标本中，诺如病毒阳性率为26.87%，其中诺如病毒GⅡ型为25.52%，高于国内其他地区的报道，而诺如病毒GⅠ型与国内其他地区的报道基本一致^{[8, 9, 10, 11]}，这种差异可能与研究时间、选择医院的数量较少（2家），以及人口流动等因素有关。

不同性别、不同年龄段人群，诺如病毒GⅠ、GⅡ型的检测率与国内外其他的地区的报道也基本一致^{[6, 10, 11, 12, 13]}，提示诺如病毒对人类普遍易感，与诺如病毒的高度变异可能存在一定关系。成年人的感染率高于未成年人及其婴幼儿（P＜0.05），可能与成年人接触诺如病毒感染的物品、食品等机会较多有关^{[6, 10, 11, 12]}。许多研究表明，诺如病毒感染受到季节影响，通常发生在春、夏和冬季^{[10, 14]}。本研究显示，诺如病毒散发感染常年均有发生，而高峰通常发生在冬、春季，峰值在2月，与我国东南部地区报道类似^{[8, 9, 10]}。提示杭州地区的气候、饮食等有关因素对诺如病毒常年的散发流行和高峰期有一定的影响。

诺如病毒分子流行病学调查显示，诺如病毒GⅡ基因型比GⅠ基因型的传播更为广泛^{[6, 14, 15]}。虽然GⅠ和GⅡ基因型均存在多样性，但GⅡ-4基因型才是造成全球急性肠胃炎暴发的优势流行株^{[15, 16, 17]}。本研究显示，诺如病毒GⅡ是杭州地区急性胃肠炎的主要病原之一，且以GⅡ-4基因型为主，与已有研究基本一致^{[2, 8, 10]}。自2006年以来，在中国GⅡ-4/2006b变异株是引起儿童和成人急性腹泻散发和流行的优势株^[5]。本研究中显示，杭州地区GⅡ-4/Sydney/2012变异株作为散发病例的优势株，比GⅡ-4/2006b变异株及其他基因型菌株更为重要，这种差异可能与人口流动、监测区域的地理分布以及宿主和人类行为如饮食等因素相关^{[5, 16, 17, 18]}。国内其他地区也陆续报道GⅡ-4/Sydney/2012变异株是导致人群发生急性胃肠炎的散发和暴发的流行株^{[3, 9, 10, 18]}。