目前对结核分枝杆菌（MTB）抗原基因多态性、人T细胞表位的研究已取得快速发展，发现部分MTB的抗原可能在提高结核病诊断或研制新疫苗方面有重要作用^[1]。为此本研究选取我国13个省份173株结核分枝杆菌复合群（MTBC）分离株，扩增和比对五种抗原（GlnA1、Mpt70、LppX、GroES和LpqH）基因，分析其人T细胞抗原表位的多态性，探讨抗原及T细胞表位多态性对宿主T细胞免疫和MTB相互作用的影响。

1. 菌株来源：自中国CDC传染病预防控制所结核室保存的2 346株国内MTBC临床分离株中，挑选173株作为本次实验用菌株（由于北京家族菌株在我国具有一定的流行优势，故本研究从保存的1 738株北京家族菌株中随机挑选86株，并从608株非北京家族菌株中挑选87株，共173株）。选取的菌株尽可能包括不同省份及不同间隔区寡核苷酸分型的菌株^[2]。间隔区寡核苷酸分型是根据之前研究确定的方法进行^[3]，并按照国际SpolDB数据库标准分为不同的家族^[4]。其中随机挑选的非北京家族中包括2株牛分枝杆菌卡介苗（Mycobacterium bovis-BCG）家族分离株FJ07113和JL06005以及New、UMANU、T、EAI 、LAM、CAS、S、Haarlem家族不同数量的菌株。本次挑选的菌株来源于13个省份，分别为安徽10株、山西17株、北京11株、福建29株、甘肃12株、广西29株、四川1株、河南11株、湖南7株、西藏10株、新疆12株、吉林14株及浙江10株，且涵盖了所有已经在我国发现的Spoligtyping类型。

2. 菌株培养和DNA提取：采用标准罗氏培养基培养试验选用的菌株，培养时间3～4周。待培养基表面有不透明淡黄色，干燥颗粒状，凸起于培养基的菜花样菌落时，用生理盐水从培养基的斜面上洗脱菌体。然后将收集到的菌液80 ℃孵育30 min灭活，离心弃去上清，用400 μl TE重悬菌体，并于沸水中煮沸30 min，离心4 min，取上清液作为13 800×g DNA扩增模板，并置于-20 ℃保存备用。

3. 目的基因引物及序列测定：引物（5′～3′）的核酸序列是根据H37Rv基因序列由Clone Manager软件设计，具体引物序列见表 1。目的基因扩增的PCR反应体系： DNA模板（500 pg）1 μl，10×PCR buffer 10 μl，引物100 nmol/L，dNTP混合液200 μmol/L，DNA Taq 酶（TaKaRa）0.5 U，ddH2O加至20 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，反应终止。

表 1 五种特异抗原编码基因信息

表选项

阳性对照加MTB标准株H37Rv 500 pg DNA，阴性对照取等量高压灭菌蒸馏水代替模板DNA。PCR产物的有无及大小用2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。所有PCR均进行至少2次以确认试验的重复性。扩增产物由北京擎科生物技术有限公司进行双向测序和拼接。

4. 抗原T细胞表位区的确定：检索免疫表位数据库（Immune Epitope Database，IEDB），获得MTB中存在的人T细胞抗原表位序列，再与H37Rv株的glnA1、mpt70、lppX、groES及lpqH基因序列进行比对，最终获得在该基因中存在的人T细胞抗原表位信息。

5. 统计学分析：首先对PCR产物测序结果和NCBI下载获得的glnA1、mpt70、lppX、groES及lpqH基因序列，进行核酸序列方向一致性调整，使用ClustalW软件进行alignment操作^[5]；再根据H37Rv株glnA1、mpt70、lppX、groES及lpqH基因序列，截取所有测序菌株与之对应的基因全长序列；然后对获得的基因用BioEdit软件进行比对，取得各基因的突变情况；分别截取其中的T细胞抗原表位区（重合表位只截取一次）和非表位区，最后用Mega 6.0软件分别计算这些序列区中的同义突变率（dS）和非同义突变率（dN）及其比值（dN/dS）。

1. PCR扩增目的基因：173株菌均扩增出glnA1、mpt70、lppX、groES和lpqH的PCR产物（图 1）。

注：A～E分别为基因glnA1、mpt70、lppX、groES及lpqH扩增结果；M：核酸Markers，1：阳性扩增，2：阴性扩增，3～8为临床分离株MTBC扩增结果 图 1 173株MTBC 5种特异性抗原的PCR扩增结果

图选项

2. 5种抗原基因中T细胞抗原表位信息：经检索IEDB及与H37Rv基因序列进行比对后，在H37Rv株分别发现glnA1基因中2个、mpt70基因中19个、lppX基因中15个、groES基因中22个及lpqH基因中29个T细胞表位（图 2）。

图 2 173株MTBC 5种特异性抗原人T细胞表位分布

图选项

3. 5种抗原基因中单核苷酸多态性（SNP）：在173株菌中，基因glnA1出现2个、mpt70出现1个非同义突变，lppX出现5个非同义突变和1个同义突变，lpqH出现1个非同义突变和1个同义突变，groES未出现突变（表 2）。其中，有9株菌在lppX基因152位的氨基酸共同位点发生了同义突变，表现较高的多态性。这9株菌包括3株T家族菌株（AH03009、FJ05395和HuN06026），5株U家族菌株（ShanX05290、XJ06183、GX06043、GX06130和XJ06116）和1株新Spoligtyping型菌株（HuN06101）。glnA1基因分别有1株临床分离菌株于243和151氨基酸位点发生非同义突变，1株为T家族（FJ05349），另1株为北京家族（BJ05024）。1株新Spoligtyping型的菌株（FJ06057）在mpt70基因的21位氨基酸发生同义突变。U家族FJ05413临床分离株在lpqH基因48位氨基酸发生非同义突变，北京家族HeN06043菌株也于此基因的70位氨基酸发生同义突变。两株M.bovis-BCG家族FJ07113和JL06005临床分离株未发现突变位点。

表 2 MTBC菌株抗原glnA1、mpt70、lppX、groES及lpqH的基因碱基变化、突变类型及相关菌株

表选项

4. 5种抗原基因中T细胞表位区的变异：在免疫表位数据库中，glnA1有2个、mpt70中有19个、lppX中有15个、groES中22个、lpqH中29个T细胞抗原表位。在lppX中，15个表位中有7个发生了改变（2个包含有2个氨基酸的改变，剩余5个具有1个氨基酸的改变）；而在mpt70和lpqH中，各有3个表位发生了改变，其中每个表位中有1个氨基酸改变（表 3）。

表 3 MTBC菌株5种抗原中T细胞抗原表位氨基酸变化情况

表选项

lppX的dN/dS值为0.19，lpqH的dN/dS值为0.36（表 4）。对于lppX及mpt70，不包括非表位区，因为表位区覆盖了整个基因，这一点也正体现了lppX、mpt70蛋白在感染后的T细胞免疫中的重要作用。glnA1具有2个非同义突变，其突变在非表位区。在173株菌中，groES基因无任何突变，证明了此蛋白基因序列的保守性。

表 4 MTBC菌株4个基因在表位区、非表位区及全基因的dN/dS值

表选项

本研究根据我国地区和基因型分布等条件，从13个省份不同间隔区寡核苷酸分型方法基因型的2 346株MTBC临床分离株中，随机选取173株，采用PCR和DNA测序方法，对glnA1、mpt70、lppX、groES和lpqH基因及其T细胞抗原表位进行分析。菌株代表性好，得出的结果有较高的可信度。

研究中选取所得的各种MTB抗原均为具有独特功能的蛋白。GlnA1（Rv2220）是一种谷氨酰胺合成酶（代谢和呼吸过程中必不可少的一种酶），MTB基因组中共发现4个glnA基因家族成员（glnA1、glnA2、glnA3和glnA4），其中以glnA1作用最为重要，主要将信使核糖核酸转化为腺苷酸，因此在MTB毒力稳定性方面具有必不可少的作用。Mpt70（Rv2875）是一种重要的具有免疫原性的分泌性脂蛋白，与Mpt83属于同一家族，其具体功能目前还不清楚。LppX（Rv2945c）是在牛结核分枝杆菌、MTB和麻风分枝杆菌中的一种分泌性脂蛋白，在感染后的免疫反应中有着重要的作用。研究表明，成熟的LppX蛋白是一类输出性脂蛋白和保护性抗原^[6]。GroES（Rv3418c）是一种热休克蛋白，主要作用与CPN60结合，激活mg-ATP并抑制ATP酶的活性。LpqH（Rv3763）是一种MTB细胞内的脂蛋白前体，负责抑制γ干扰素调节蛋白 HLA-DR及mRNA在人类巨噬细胞中的表达。

宿主-病原的协同进化关系主要表现在宿主的免疫压力与病原体的免疫逃逸。对某些病原体的研究表明为了逃避宿主的免疫，其抗原编码基因表现为高度可变，这是一种逃避人体免疫系统的多向性选择^{[7, 8, 9, 10]}。研究发现MTB的T细胞抗原表位具有较高的保守性，并推断MTB缺少抗原变异及免疫逃逸^[11]。lppX基因中1个SNP位点表现了较高的多态性，说明此基因受到了宿主的免疫压力而表现为抗原序列变化。lppX基因中，15个表位中有7个发生了改变；进一步研究需要证实，在lppX中抗原表位的高度改变是由于免疫压力、其他的选择压力还是仅仅是随机的基因漂移造成的。基因mpt70中1个表位发生改变、lpqH中2个表位发生改变，可能反映了此抗原参与了逃避宿主免疫的分化选择。基因glnA1的非表位区的多态性，对该菌株的免疫反应影响较小。

在173株菌中，有9株菌在lppX152位的氨基酸发生了相同的突变，与Jiang等^[12]的研究一致。这9株菌包括3株T家族菌株，5株U家族菌株和1株新Spoligtyping型菌株。所以，对于同一型的菌株来说，SNP位点可作为进化的标识，而对于不同型别的菌株来说，它们是表现强选择压力的同型SNP。结核分枝杆菌中基因lppX的高突变性，可能反映了该抗原参与了逃避宿主免疫的分化选择。然而，同义的突变并不造成蛋白的改变，在lppX中氨基酸序列变化并不大。glnA1、mpt70及lpqH基因具有一定的多态性，但只是个别菌株的变化。而groES基因无任何位点的改变。这些研究结果均与MTB基因的高保守性基本符合。

groES相对保守，不具有多态性，可能对MTB的鉴定、诊断及新型疫苗的研制具有重要作用。在mpt70、lpqH及glnA1基因中，单株菌发生的突变点是否在其逃避宿主的免疫或增加菌株的耐药性方面中起作用，也需进一步证实。而lppX基因具有相对较高的变异度，将来在研制含有此抗原的新疫苗时需要考虑到菌株间变异对其免疫效果的影响。

综上所述，MTB相关抗原中的人T细胞抗原表位与既往研宄结果基本一致，存在保守性的基因，也存在个别高变性的区域，为后续幵发新的抗结核病疫苗提供了部分理论基础。