2016, Vol. 37
文章信息
- 何军, 刘丽萍, 侯赛, 龚磊, 吴家兵, 胡万富, 王建军.
- He Jun, Liu Liping, Hou Sai, Gong Lei, Wu Jiabing, Hu Wanfu, Wang Jianjun.
- 安徽省2株人感染H9N2流感病毒基因特征
- Genomic characteristics of 2 strains of influenza A (H9N2) virus isolated from human infection cases in Anhui province
- 中华流行病学杂志, 2016, 37(5): 708-713
- Chinese Journal of Epidemiology, 2016, 37(5): 708-713
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2016.05.025
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文章历史
- 收稿日期: 2015-12-15
2. 230601 合肥, 安徽省疾病预防控制中心微生物检验科;
3. 230601 合肥, 安徽省疾病预防控制中心急性传染病防治科
2. Department of Microbiology Laboratory, Anhui Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hefei 230601, China;
3. Department of Acute Infectious Diseases, Anhui Provincial Center for Disease Control and Prevention, Hefei 230601, China
H9N2流感病毒长期在家禽和野鸟中循环流行[1, 2]。根据流行病学和遗传学研究可将H9N2病毒血凝素基因（HA）分为欧亚系和美洲系，欧亚系又包括3个分支：A/chicken/Beijing/1/94（BJ/94）、A/quail/Hong Kong/G1/97（G1）和A/duck/Hong Kong/Y439/97（Y439），BJ/94和G1类似株病毒自1990年后成为我国禽间主要流行株[3]。1998年，人类首次从猪中分离到H9N2病毒[4]，1年后首例人感染H9N2病例在香港地区出现[5]。近年来，禽间分离到HA-226L突变的H9N2病毒逐渐增多，该突变使其更易于感染表达SA-α-2，6 Gal受体的呼吸道上皮细胞，增加人类感染的可能性[6]，同时HA蛋白裂解位点、NA蛋白茎部有无缺失以及PA蛋白的100、356和409位点氨基酸残基特征亦与人易感倾向相关。由于该亚型病毒引起的临床症状较轻，极易被忽视，故人感染病例鲜有报道。安徽省于2015年4月和9月先后发现2例儿童感染H9N2流感病例，症状较轻均已治愈；安徽省流感参比中心用实时荧光定量RT-PCR同时检测A型通用、H1pdm（2009）、H3、H5、H7、H9、N1、N2亚型，H9和N2检测呈阳性；经中国CDC病毒病预防控制所国家流感中心确诊后进行病毒分离培养，获得A/Anhui/33329/2015（H9N2）（AH/33329）和A/Anhui/43269/2015（H9N2）（AH/43269）2株毒株。本研究重点描述2株H9N2病毒全基因组分子进化特征，聚焦其重要氨基酸位点突变情况，为进一步研究该病毒提供理论依据。
材料与方法1. 材料：合肥市H9N2咽拭子样本来自于人感染H7N9流感疫情处置过程中密切接触者（密接）病例；滁州市咽拭子样本来自于流感样监测病例，2例标本均按生物安全要求冷链运输至安徽省流感参比中心。
2. 序列来源及参比序列：2株H9N2毒株全基因组序列信息从国家流感中心序列数据库中获取；参比序列：A/Lengshuitan/11197/2013（H9N2）（L11197）、A/Chicken/Shanghai/F/98（H9N2）（SH/98）、BJ/94、G1、Y439、A/Jiangxi/1/2013（H10N8）（JX1）、A/Shanghai/1/2013（H7N9）（SH1）、A/Shanghai/2/2013（H7N9）（SH2）、A/Anhui/1/2013（H7N9）（AH1）。以上毒株8个基因片段的GenBank或GISAID号分别为KM455869～KM455876；AY253750～AY253756、AY743216；AF156380、AF156480、AF156466、AF156452、AF156438、AF156423、AF156409、AF156398；AF156477、AF156378、AF156463、AF156449、AF156435、AF156421、AF156407、AF156396；AF156476、AF156377、AF156462、AF156448、AF156434、AF156420、AF156406、AF156395；KM392408～KM392415；EPI439486～EPI439494；EPI439495～EPI439502；EPI439503～EPI439510。
3. 基因序列分析：所有序列使用BioEdit软件修齐，并用Mega 6.0软件，采用邻接（NJ）法构建系统进化树（Bootstrap=1 000）。
4. 氨基酸序列分析：使用DNAMAN软件分析基因序列，寻找可用开放阅读框（ORF）并推导出氨基酸序列，导入BioEdit软件进行变异位点分析。
结 果1. 流行病学特征：合肥市病例张某某，女，4岁，托幼儿童；2015年4月14日发病，主要症状为发热（最高39.5 ℃）、咳嗽；4月16日治愈，病程3 d；为人感染H7N9流感患者密接追踪时发现，4月15日检测为H9阳性；经流行病学调查，患儿发病前无活禽接触史，但有活禽市场暴露史。滁州市病例陶某某，男，6岁，学生；2015年9月6日发病，以发热症状为主（最高38.7 ℃）；9月7日治愈，病程2 d，为常规流感监测时发现；9月8日检测为甲型流感病毒通用核酸阳性，9月16经安徽省CDC实验室复核，结果为H9N2阳性；经流行病学调查，患儿无活禽及活禽市场暴露史。
2. 各基因片段相似度分析：安徽省2株人感染H9N2流感毒株8个基因片段经NCBI网站BLAST功能查找同源性最高序列及相似度见表 1，其HA基因分别与A/chicken/Qingdao/013/2014（H9N2）和A/environment/Hunan/28028/2014（H9N2）同源性最高，相似度达99%；NA基因分别与A/chicken/Jiangxi/17913/2013（H9N2）和A/chicken/Shaoxing/5453/2013（H9N2）毒株的同源性达99%；AH/33329的PA基因和AH/43269的PB1、M、NS基因与上海市、江苏省、浙江省的H7N9禽流感病毒高度同源，相似度均为99%。
3. 各基因片段系统进化分析：选用BJ/94、G1和Y439毒株相似序列，以及2013年湖南省人感染H9N2毒株（L11197）和江西省人感染H10N8毒株（JX1）的相似序列进行基因进化分析。结果显示，2株H9N2毒株PB2与MP基因属于G1类似株，其余6个基因属于SH/98类似株[7]，MP与上海市、浙江省、江苏省分离的H7N9亲缘关系较近，PB2基因与江西省分离的H10N8和H6N2亲缘关系相似；Anhui/43269的PB1基因与H7N9毒株亲缘关系较近，PA基因中该毒株与H10N6和H10N8更为相似；2株H9N2分离株在NP基因中呈现明显不同的2个独立分支，且NA基因中也出现在不同的分支上，而HA和NS基因上安徽省H9N2分离株高度同源（图 1）。
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| 图 1 H9N2病毒8个片段进化树 |
4. 氨基酸位点分析：安徽省2株H9N2毒株HA蛋白受体结合位点均发生Q226L、Q227M、H183N、E190T突变，M2蛋白发生S31N突变，NS1蛋白发生G47S、L77F、V111I、V180I突变和NS2蛋白发生G22R突变，PB1蛋白均有I368V突变，且HA裂解位点均为PSRSSR\GL排列，NA蛋白茎部均发生63～65位氨基酸缺失。AH/43269的HA蛋白发生T189D突变，NA蛋白发生Q93L、V192I、S266R和V287I突变，PB1蛋白发生N158S突变。AH/33329的NA蛋白发生G111S、K143Q、I254V突变，PB1蛋白发生K197R、T434N、T469I、V591I突变，PA蛋白发生V100A、K356R、S409N和D394N多位点突变（表 2）。
安徽省2株H9N2毒株HA蛋白均发生Q226L、H183N、E190T突变，Q226L突变使H7N9获得与人上呼吸道上皮细胞唾液酸SAα-2，6 Gal 受体结合的分子基础[8]；H183N、E190T和Q226L位点的突变与呼吸道飞沫传播密切相关[9]。M2蛋白发生S31N突变，提示其可能对金刚烷胺类药物不敏感。禽间流行循环的H9N2病毒发生重要的分子突变后，感染人类的能力增强，且具备潜在的人际间传播能力，如果这些分子突变占据主要优势，将会形成潜在的流感大流行风险。
早在1998年中国已开始实施禽间疫苗接种计划，用于预防禽间H9N2流行[10]，而我国首次证实的5例人感染H9N2病毒也刚好发生在1998年[11]，随后零星报道的H9N2病例大部分集中在香港地区和南方省份，而中部地区仅2013年湖南省报道1例[12]，安徽省2例人感染禽源H9N2病例为本省首次报道。由于该病毒感染后临床症状呈典型的流感样症状，与其他季节性流感不易区分。因此需进一步提高流感监测网络灵敏度，尽早发现新亚型流感病毒，追踪感染源，阻断新病毒的进一步传播。近些年禽间H9N2病毒分离率的逐年增加[13]，病毒抗原性和宿主特异性的不断变化，以及人群的偶发感染等均与该病毒基因进化相关，因此对H9N2病毒的分子特征研究尤为重要。
安徽省2例病例由于发现时已痊愈，基因组进化分析显示感染病毒的外部基因与当前禽间流行的H9N2病毒高度同源，且部分内部基因与已感染人类的H10N8和H7N9流感病毒相似度较高，同源性较高的毒株均来自活禽交易频繁的江苏、浙江、江西等地。此外，基因进化分析显示，PB2和M基因源自G1类似株，而香港人感染H5N1内部基因也来自于G1系[14]，且PA基因含有人流感病毒分子特征。因此，本研究报道的2株人感染H9N2流感病毒，在适宜的条件下极有可能形成新病原，对人类健康造成威胁。
志谢 感谢中国CDC病毒病预防控制所国家流感中心工作人员的大力支持以及合肥市、滁州市同仁的密切配合 利益冲突 无| [1] Alexander DJ. A review of avian influenza in different bird species[J]. Vet Microbiol,2000,74(1/2):3-13. DOI:10.1016/S0378-1135(00)00160-7. |
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