登革热是传播速度较快的蚊媒病毒病之一，近30年在全球超过100个国家引起暴发流行，全球约25亿～40亿人存在感染DENV的风险，每年约有3.9亿人感染DENV^[1-4]，已经成为全球面临的重大公共卫生问题^[5-6]。由于经济全球化发展、国际间旅行和城市扩张等因素影响，我国由输入病例引起的登革热暴发流行风险不断升高^[7-8]，广东^[9-11]、云南^[12]、福建^[13]、河南^[14]等省均报告了由输入病例引起的登革热暴发。广西壮族自治区（广西）白纹伊蚊分布广泛且密度高，发生登革热流行风险极高^[15]，曾于1980年和1986年两次报告登革热疫情暴发^[16]：1980年广西合浦、钦州市暴发第一次登革热疫情，共报告1 515例病例，死亡2例；第二次登革热疫情于1986年在北海市暴发，106名当地居民被感染。之后28年，广西没有本地登革热疫情报告。2014年广西暴发第三次本地登革热疫情，共报告登革热病例854例。为明确此次疫情特征和病原来源，本文对此次登革热疫情的流行病学和病原特征进行分析。

1. 病例定义：依据原卫生部颁发的《登革热诊断标准》（WS 216-2008），分为疑似、临床诊断和实验室诊断病例。根据获得感染地域不同分为输入病例和本地病例，本地病例指发病前14 d内未离开本县区（现住址）的登革热病例；输入病例包括境外输入病例和境内输入病例两类。境外输入病例指发病前14 d内到过登革热流行的国家或地区的病例。境内输入病例是指发病前14 d内离开本县区（现住址）、到过本县区外的境内登革热流行地区的病例。

2. 研究方法：

（1）流行病学资料收集和分析：报告的登革热病例信息来自中国CDC信息系统和现场流行病学个案调查。病例流行病学个案调查由当地CDC工作人员与患者面对面访谈完成，主要变量包括患者性别、年龄、职业等。数据采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。

（2）标本收集和DENV NS1抗原检测：医疗机构医务人员对诊断为登革热疑似病例采集非抗凝血液标本2～5 ml，24 h内送辖区市级CDC进行DENV NS1抗原（北京万泰生物药业股份有限公司）检测。分离的血清保存于2 ml螺口冻存管中，置-70 ℃冰箱保存。DENV NS1抗原检测阳性标本送广西CDC进行病毒分离和DENV血清分型。

（3）核酸检测：采用磁珠法提取病例血清中病毒RNA（Ambion by life technologies），血清分型和E基因扩增采用一步法RT-PCR试剂盒进行检测（Qiagen），DENV通用引物和血清分型引物序列参考《登革热诊断标准》（WS 216-2008），E基因扩增引物参考文献^[17]。实验操作步骤参考试剂盒说明书。

（4）序列测定：测序均在生工生物工程（上海）股份有限公司完成。用于序列进化分析的参考株来自GenBank，使用ClustalX 1.8 软件和Mega 6.0 软件进行核苷酸序列比对和一致性分析，并用邻接法（NJ）构建核苷酸系统进化树，可信度评估采用Bootstrap，取1 000次重复。

1. 流行病学特征：广西于2014年6月13日报告首例输入性登革热病例，9月23日报告首例本地病例；2014年6月13日至2014年12月8日共报告登革热病例854例，其中临床诊断病例142例，实验室诊断病例712例，无死亡病例。854例病例中，男女性发病数比为1 ∶ 1.34（365/489）；发病年龄以青壮年占多数，15～59岁组占总病例数的83.61%，最小1岁，最大81岁。职业以干部职员（26.11%）为主，其次为商业服务者（20.49%）和家务及待业人员（16.04%）（表 1）。病例主要集中在2014年9月22日至10月21日出现，期间共累计报告680例（79.63%），平均每天报告病例21.94例（图 1）。854例病例中，91.33%（780/854）为本土患者，8.67%（74/854）为输入性病例；广西所辖14个市中，3个市同时报告本地病例和输入病例，9个市只有输入病例报告，2个市无病例报告。报告的74例输入性病例中，其中3例来自泰国病例输入中国南宁市（6月20日报告）；67例来自广东省，只有1例于9月23日前输入至桂林市，其余66例于9月28日至11月12日期间输入；4例从广西南宁市输出（表 2）。

表 1 2014年广西报告登革热病例人口学特征

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表 2 2014年广西登革热病例地区分布

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图 1 2014年广西登革热病例报告时间分布图（按发病日期统计）

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2. DENV NS1抗原检测：对收集的862例疑似登革热病例急性期血清标本862份进行DENV NS1抗原检测，阳性712份。

3. DENV血清分型：应用RT-PCR方法对526份DENV NS1抗原阳性血清标本进行DENV血清分型，414份分型阳性，其中DENV-1血清型345份（83.33%），DENV-2血清型69份（16.67%），未检出DENV-3血清型、DENV-4血清型。

4. DENV-1的E基因核苷酸序列分析：对DENV-1检测阳性标本进行E基因序列测定，共获得120条E基因序列（1 485 bp），核苷酸序列一致性为90.90%～100.00%，未发现核苷酸插入或缺失。114条序列来自南宁市本地病例，其中113条序列与新加坡2013年分离的登革毒株（SG EHI D1/529Y13，KJ806952）核苷酸序列一致性最高，为100.00%；与马来西亚、缅甸、泰国及中国广东省2014年同期分离的DENV-1毒株序列一致性为90.62%～97.33%；6条序列来自输入性病例，其中2条序列来自泰国输入性病例（6月20日报告），4条序列来自中国广东省输入性病例，与南宁市本地病例核苷酸序列一致性分别为96.85%和90.90%～97.30%。

根据E基因核苷酸序列一致性和标本采集时间，选取9条南宁市本地病例序列为代表，6条输入性病例序列以及从NCBI下载不同国家、地区DENV-1的E基因核苷酸序列，以DENV-2、DENV-3和DENV-4为外株，构建NJ进化树。结果显示，2014年广西登革热疫情中的DENV-1存在2种基因型：Ⅰ型和Ⅴ型，其中基因Ⅰ型分为3个分支，来自中国南宁市本地病例的序列在同一分支上（clade 1），与新加坡毒株亲缘性最高，同属基因Ⅰ型；2例泰国输入性病例是中国南宁市最早报告的输入性病例（2014年6月20日报告），其序列（DNEV-1/GXNN/2014004Thailand和DNEV-1/GXNN/2014005 Thailand）在进化树上与来自泰国的毒株在同一分支上（clade 3）；从广东输入的4例病例序列分别来自北海、河池和梧州市报告的输入性病例，与2014年广东省登革疫情流行株共同分布在基因Ⅰ型clade 2和基因Ⅴ型分支上（图 2）。

●为本地病例，▲为输入病例；参考序列标签标记为GenBank号/毒株名称 图 2 2014年广西DENV-1 E基因核苷酸进化树

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5. DENV-2的E基因核苷酸序列分析：测序获得40条梧州市本地病例E基因序列，长1 485 bp，序列一致性为100.00%；在NCBI进行比对，与广东2014年DENV-2分离株（D14005）同源型最高，E基因核苷酸一致性为99.80%；NCBI中只收录1条广西1987年登革热疫情中分离的毒株43（AF204178），梧州市本地病例与毒株43的核苷酸序列一致性仅为94.21%。从NCBI下载DENV-2的E基因序列，序列按照分离时间、地点和核苷酸一致性进行筛选，选取3条梧州市本地病例序列和100株NCBI下载的DENV-2序列，构建E基因NJ进化树。结果显示，毒株43属于Asian-2基因型，梧州市本地病例序列与其不在同一分支上，而是与2014广东分离株最近，在同一分支，属于Cosmopolitan基因型（图 3）。

●为本地病例；参考序列标签标记为GenBank号/毒株名称 图 3 2014年广西DENV-2型E基因核苷酸进化树

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DENV分为4种血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4），不同国家和地区流行的DENV具有基因型和序列地域特异性，可作为登革热病原溯源的主要依据^[18]。广西曾报告DENV-2和DENV-3引起的登革热疫情暴发，1980年发生第一次登革热暴发流行主要由DENV-3引起，1986年暴发的第二次登革热疫情病原为DENV-2^[16]，2014年广西报告第三次本地登革热暴发疫情，经实验证实由DENV-1和DENV-2同时引起。其中DENV-1首次在广西引起登革热暴发流行，83.25%（345/414）的血清分型阳性病例标本中检测到DENV-1核酸，是此次登革热疫情的主要病原；在中国南宁市本地登革热病例中同时检测到基因Ⅰ型和Ⅴ型两种基因型，99.12%（113/114）来自南宁市本地病例的序列和2014年6月20日报告的2例从泰国输入病例的序列均属于基因Ⅰ型，但在进化树上位于不同的分支上，其中泰国输入病例的序列位于基因Ⅰ型clade 3分支上，而113例中国南宁市本地病例的序列与来自新加坡2013年的流行株单独成一个分支（clade 1），可见南宁市本地登革热疫情病原可能来源于新加坡，6月20日报告的泰国输入病例并未引起传播。来自梧州市40例病例具有共同的E基因序列，与广西1987年登革热疫情中分离的DENV-2毒株43在不同的分支上，而是与广东2014年登革热疫情中分离到的DENV-2毒株（D14005）一致性最高，并在进化树同一分支上，说明梧州市登革热疫情的病原可能从广东省输入。

本次暴发共发现74例输入性病例，其中67例（90.54%）来自广东，3例（4.05%）来自泰国，其他县区从南宁市输入4例（5.40%）。能追溯的首例输入病例是2014年6月13日来自泰国的病例，但流行病学调查和基因序列分析结果表明，该输入病例并未引起本地登革热疫情传播；8月19日最早报告的本地病例所携带的病毒传播导致了此次暴发疫情，其病毒可能由新加坡等东南亚国家输入，但不能追溯到首例输入病例，无法确定本土病例和来自新加坡或马来西亚输入性病例/媒介在此次暴发之间的联系。此情况和2014年广东省登革热暴发疫情类似^[19]，提示应加大对出入境人员登革热监测力度，尽早发现输入性病例；加强登革热流行病学和病原学监测，开展更为深入的现场调查，评估蚊媒繁殖动态等措施暴露DENV的传播关系。

登革热的潜伏期为3～15 d。病例于9月22日至10月21日集中出现，11月初后病例报告显著下降，12月8日后不再有病例报告。此次疫情得到有效控制的原因，除了考虑采取了防蚊灭蚊等措施外，也需要考虑11月初气温下降导致的蚊媒活动度减少以及蚊媒密度降低的原因^[20]。另外，从首例本土病例出现到采取积极防控措施需要34 d，从采取积极防控措施到疫情显著下降需要超过45 d（3个最长潜伏期），提示要加强临床医生对登革热病例诊断、报告意识；加大病例报告地区的防控措施，加强国际协作，对减少广西登革热疫情暴发、降低疫情规模将大有裨益。

综上所述，推测2014年广西登革热暴发疫情存在两条不同的传播链，从中国广东省输入的Cosmopolitan基因型DENV-2引起了梧州市登革热本土传播，而来自新加坡的基因Ⅰ型DENV-1则引起中国南宁市本土登革热疫情暴发。在登革热高度易感地区，单个输入的病例便可引发流行^[5]。广西是登革热暴发流行高风险地区，东与中国广东省交界，南与越南接壤，需警惕再次发生由输入性病例或媒介引起本地登革热暴发流行。

本研究有局限性。DENV血症期较短，发病5 d后采集的血液标本中DENV核酸检出率低于45.8%^[21]，本文只对526例发病5 d内采集的病例血液标本进行病毒血清分型，阳性率仅为48.48%，但不影响对疫情主要病原型别和来源的判断。另外，由于各种原因未能追溯到首例输入病例，以及NCBI中收录的近几年越南、泰国等东南亚国家DENV序列较少，无法确定本土病例和来自新加坡或马来西亚等国家输入性病例/媒介在此次暴发之间的联系。