耐多药（MDR）结核病给全球结核病控制带来严重的挑战^[1-2]。目前我国耐药结核病控制形势十分严峻，耐药率及广泛耐药率均高于全球的平均水平^[3-4]，MDR病例的治愈率低、死亡率高^[5]。结核病的潜伏期较长，传统的流行病学方法对其传染源的追踪和传播规律的认识有一定的局限。随着高通量测序技术的发展，应用全基因组测序技术为传染病的传播机制研究提供了新的检测手段^[6]。该方法目前已在多个结核病流行病学研究中使用^[7]，显示了其独特的优势。2008-2012年某结核病定点医院（A医院）7名患者与另一结核病定点医院（B医院）2名患者分离的结核分枝杆菌VNTR基因型（9+3位点组合）具有高度同源性^[8]，本研究对这9名患者分离的结核分枝杆菌进行全基因组测序，探讨全基因组测序技术在流行病学研究中的重要作用。

对象与方法

1.流行病学调查：获得患者的知情同意后，对2008-2012年A医院7名患者与B医院2名患者进行调查，采集患者基本信息，包括姓名、年龄、住址、病史等，询问患者密切接触者情况以及日常活动范围。

2.全基因组测序：在生物安全二级实验室中采用十六烷基三甲基溴化铵法从9名患者分离的结核分枝杆菌阳性培养物中提取基因组DNA，80 ℃水浴30 min灭活，纯化后送至上海派森诺生物科技有限公司，依照Illumina公司双侧测序的标准流程构建插入长度约300 bp的测序文库。基于Illumina Hiseq 2000平台，实际测序深度为平均100倍以上，双侧测序数据采用Bowtie2和参考序列H37Rv（GenBank AL123456）比对，采用SAMtools/BCFtools比对分析得到菌株的单核苷酸多态性（SNP），分析菌株间的遗传差异时，排除基因组上高度重复区域（如PE/PPE家族基因）和耐药相关基因突变（受药物选择压力），簇病例间差别少于12个SNP位点以内定义为近期传播^[7]。基于SNP数据，采用Median-joining法构建可能的传播网络示意图。

结果

1.基本情况：通过基因型分析发现有9株结核分枝杆菌具有相同的可变数目串联重复序列（VNTR）基因型，提示可能存在传播关系。资料显示9名患者均为上海市人，男性占89%（8/9），其中6名为初治患者，3名为复治患者。9名患者中3名患者死亡，其中1名患者因其他疾病死亡（表 1）。

为了进一步研究这些病例之间是否存在接触或传播关系，本研究对患者进行流行病学问卷调查，调查结果显示，病例1、2、3、4、5、6、8目前就诊于A医院，病例7、9就诊于B医院。9名患者确诊结核病前均因其他类疾病而分别入住于其他不同的医院，其中病例3与病例4来自于同一医院（C医院）同一病房，病例6和病例8来自于A医院不同病房，以上两组患者存在流行病学联系。其余的5名患者分别来自5家不同的医疗机构，且这些医疗机构分属不同的行政辖区，未找到病例间明显的接触证据。从诊断时间来看（图 1）病例2最先发病，提示可能为传播事件的传染源。

2.基于全基因组测序的相互关系：对VNTR分型成簇的9株结核分枝杆菌进行全基因组测序，根据菌株的SNP差异构建相互关系图，结果显示，9株结核分枝杆菌分为两个相对独立的传播关系网络，其中5名A医院病例和2名B医院病例分离的结核分枝杆菌在一个大簇，病例2和病例3分离的结核分枝杆菌在另一个小簇中，两簇遗传距离最近的菌株之间遗传距离相差15个SNP（图 2）。

进一步分析发现，大簇的7株结核分枝杆菌中，任一菌株与同簇其他菌株的最近遗传距离 < 9个SNP位点，且7株结核分枝杆菌具有相同的异烟肼、利福平和链霉素相关耐药基因突变，提示其存在相互传播关系，且传染源是MDR患者。7株结核分枝杆菌共形成了3个分支，表明存在至少3次传播事件。病例2和病例3分离的结核分枝杆菌形成另一个小簇，与上述7株结核分枝杆菌不同的是，尽管这两株结核分枝杆菌均从MDR患者中分离，但由于利福平的耐药突变不同，提示传染源可能不是MDR患者，而是耐异烟肼的患者。

在传播过程MDR患者在不断地积累新的耐药，不同分支均有新的耐药突变发生，部分菌株发展为广泛耐药菌株，包括病例4、7和9。且病例4有可能直接将广泛耐药结核（XDR）传染给病例7和9（图 2）。

讨论

通过结合全基因组测序技术和分子流行病学方法，本研究回顾性描述了一起MDR菌株传播事件。基于全基因组测序数据构建的传播网络，能比较准确鉴别传播途径和方向，识别传染源或传播过程中可能的缺失环节。根据本研究对基因组成簇（差异≤12个SNPs）的定义，9株VNTR成簇的结核分枝杆菌经过全基因组测序分析分成了两个传播网络（7+2）。同时，传播网络呈星状分布，缺少“源菌株”，提示可能存在未发现的传染源。此外，在传播过程中部分菌株积累了新的耐药突变。

全基因组测序能在基因组水平揭示细菌在传播过程中的遗传变异，准确判定传播方向。比如加拿大哥伦比亚区的结核病暴发研究表明^[7]，相同VNTR的结核分枝杆菌经全基因组测序分析显示是两起独立的传播事件。在本研究中，VNTR成簇提示9名病例间存在传播关系，但流行病学调查发现除了病例3与病例4、病例6和病例8之外，其他病例之间均不存在流行病学直接联系。由于结核病是一种呼吸道传染病，患者之间存在偶然传播的可能性，不能排除在医院外或医疗场所的偶然接触传播导致的感染发病，而传统流行病学很难通过调查获得偶然传播证据，而常用的VNTR分型方法提供的信息量有限，不能进一步分析传播方向。全基因组测序分析则进一步提供了这些患者存在传播关系的证据，同时帮助判断传播方向和可能的传染源。此外，流行病学调查显示病例3与病例4之间、病例6与病例8之间存在直接联系，但是从全基因组测序的分析结果来看，病例6与病例8确属同一传播链；病例3与病例4不存在传播联系。

另外，本研究中不管是较大的传播链（簇），还是2例患者的小簇，通过全基因组测序分析，均未发现明确的“源”病例，说明传染源还未找到、传播链不够完整，另一种解释是源病例有较长时间的诊断延迟，在未被发现前已经传染多人，菌株在不同个体内积累突变，造成“源”病例缺失假象。同时，本研究也发现，在不同个体内，耐药菌株分别获得了不同类型的新耐药位点突变，提示个体的治疗可能存在不恰当或依从性不好等问题。

通过结合全基因组测序技术和分子流行病学方法，本研究从基因组和流行病学两方面描述一起MDR结核病传播事件。相比于传统的基因型分型方法，二代测序技术能够提供更全面的病原菌基因组特征，监测传播过程中遗传特征的变化，从而更准确鉴定传播途径。

利益冲突: 无