2017, Vol. 38
文章信息
- 李柏生, 陈柳军, 柯碧霞, 林洁敏, 徐励琴, 谭海玲, 何冬梅, 梁宇恒, 柯昌文, 张永慧.
- Li Baisheng, Chen Liujun, Ke Bixia, Lin Jiemin, Xu Liqin, Tan Hailing, He Dongmei, Liang Yuheng, Ke Changwen, Zhang Yonghui.
- 广东省和广西壮族自治区部分地区2014-2016年宋内志贺菌病原学特征分析
- Etiologic characteristics of Shigella sonnei strains isolated from some areas of Guangdong province and Guangxi Zhuang Autonomous Region of China, 2014-2016
- 中华流行病学杂志, 2017, 38(11): 1541-1545
- Chinese Journal of Epidemiology, 2017, 38(11): 1541-1545
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2017.11.021
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文章历史
收稿日期: 2017-05-02
2. 545007 广西壮族自治区柳州市疾病预防控制中心微生物检验科;
3. 515041 广东省汕头市疾病预防控制中心微生物检验科;
4. 516001 广东省惠州市疾病预防控制中心微生物检验科
2. Microbiology Department, Liuzhou Prefecture Center for Disease Control and Prevention, Liuzhou 545007, China;
3. Microbiology Department, Shantou Prefecture Center for Disease Control and Prevention, Shantou 515041, China;
4. Microbiology Department, Huizhou Prefecture Center for Disease Control and Prevention, Huizhou 516001, China
近年来宋内志贺菌的流行比例在逐年上升[1]。2014-2016年广东省在惠州、清远和汕头市分别发生3起宋内志贺菌暴发事件。与此同时，邻近的广西壮族自治区柳州市也在2015年和2016年发生2起宋内志贺菌感染暴发，为了进一步了解这几起宋内志贺菌暴发分离株的耐药特征、分子遗传特征及亲缘关系，本研究将暴发事件中分离到的14株宋内志贺菌与常规监测分离到的6株宋内志贺菌进行了抗生素敏感性试验、PFGE聚类分析，并选择6株代表性菌株进行全基因组测序分析。
材料与方法 (1) 菌株及试剂来源2014-2016年广东省和广西壮族自治区柳州市宋内志贺菌暴发分离株14株和散发分离株6株。选择性分离培养基选用SS培养基（北京陆桥技术股份有限公司），志贺菌分型血清购自日本Denka Seiken公司，所有试剂均在有效期内使用。
(2) 抗生素敏感性试验采用最低抑菌浓度法（MIC法），选择12种抗生素（氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、头孢噻肟、亚胺培南、庆大霉素、阿奇霉素、四环素、氯霉素、萘啶酸、环丙沙星和复方新诺明）。药敏试验采用ATCC25922大肠埃希菌做质控菌株，结果采用WHONET 5.4软件进行录入和分析。
(3) 细菌DNA提取细菌基因组DNA提取采用DNA min Kit（德国Qiagen公司），按试剂盒操作手册进行提取，核酸的浓度用Qubit DNA-HS进行定量，经测定所有样品的A260/A280比值均在1.8~2.0之间，基因组DNA的浓度＞100 ng/μl，每个样品的最终体积是50 μl。
(4) PFGE分型参照美国PulseNet宋内志贺菌PFGE标准操作方法，用Xba Ⅰ内切酶消化基因组DNA后进行PFGE，并通过BioNumerics v6.6软件分析图谱，方法采用非加权组平均法（unweighted pair group method using arithmetic averages），聚类相似性系数采用距离法计算，得到菌株带型相似性的聚类分析树。
(5) 基因组测序和序列拼接全基因组测序在Iontorrent PGM平台上完成，测序文库为200 bp，测序深度为100~200 X。本研究将获得的菌株全基因组测序reads在CLC Genomics Workbench v9.5.3平台上进行de novo方式拼接和组装。组装产生的contigs进一步进行耐药基因和毒力基因的鉴定和分析，应用在线分析工具ResFinder，采用Blast方法，将contigs上传比对分析，选择核苷酸相似度匹配参数为80%~100%，输出匹配度最高的基因[2]。
(6) 基于WGS-SNPs进化分析将6株代表性菌株的基因组与NCBI上获得的其他51株全基因组序列（表 1）使用kSNP3进行全基因组的单核苷酸多态性（SNPs）（wg-SNPs）鉴定和构建最大似然树进化分析[3]。首先应用kSNP3的Kchooser工具对输入的57个全基因组进行计算，参数设置为默认，筛选出最合适的k-mer值为k19，并以k-mer 19为计算参数，鉴定出核心SNPs，并以核心SNPs组成的序列构建最大似然树。
20株志贺菌经传统生化反应和血清学凝集试验鉴定均为D群宋内志贺菌。抗生素敏感性分析显示，20株菌对氨苄西林、四环素、庆大霉素的耐药率均为100.0%、对复方新诺明和萘啶酸的耐药率为94.7%、对氨苄西林/舒巴坦和头孢唑林的耐药率为58.0%、对头孢噻肟的耐药率为42.1%、对阿奇霉素、氯霉素和亚胺培南敏感（表 2）。多重耐药分析显示，全部菌株均对β-内酰胺类、氨基糖苷类和四环素类抗生素同时耐药。其中有7株对5类8种抗生素同时耐药，耐药谱为β-内酰胺类（氨苄西林+氨苄西林/舒巴坦+头孢唑啉+头孢噻肟）+氨基糖苷类（庆大霉素）+四环素类（四环素）+喹诺酮类（萘啶酸）+磺胺类（复方新诺明）。
广东省的3起暴发菌株带型均不一致（分别属于Cluster A、Cluster C、Cluster D）；广西壮族自治区柳州市的2起暴发菌株带型不一致（分别属于Cluster A、Cluster B）；其中2016年汕头市暴发菌株和2015年柳州市暴发菌株带型一致（Cluster A），而且与2株广东省散发菌株带型一致；4株柳州市的散发菌株带型一致（Cluster E），与暴发菌株带型不同（93.2%相似度，仅存在2条带的差异）；5起暴发的菌株带型之间的条带差异数在1~2条之间（图 1）。
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| 图 1 2014-2016年20株宋内志贺菌暴发分离株PFGE聚类分析 |
选择其中6株代表性分离株（5起暴发菌株各挑选1株，散发菌株随机挑选1株）进行全基因组测序，按de novo进行组装，将组装好的contigs上传至国际基因组流行病学中心进行耐药基因和毒力基因的鉴定和分析。经in silico MLST分析，这6株代表性分离株具有相同的MLST序列型，为ST-152（purA-7，mdh-14，recA-7，gyrB-7，adk-11，icd-1，fumC-63）。耐药基因鉴定显示均携带四环素、氨基糖苷类、磺胺类和β-内酰胺类耐药基因，与表型耐药检测的结果一致，同时也均携带了常见的志贺菌毒力基因（表 3）。
进一步将这6株宋内志贺菌的基因组序列与NCBI上已公布的其他国家和地区的51个全基因组代表序列采用kSNP3软件基于wg-SNPs构建系统发育树结果显示，6株分析菌株通过wg-SNPs分析进一步区分开。与其他国家和地区的宋内志贺菌株相比，中国广东省和广西壮族自治区柳州市的全部的6株宋内志贺菌代表株均处于同一个分支上，与2005年分离自中国的1株菌株和1998年和1999年韩国分离的菌株聚集成簇。广东省和广西壮族自治区柳州市的宋内志贺菌株又可进一步分为多个不同的小分支。
讨论广东省和广西壮族自治区部分地区分离的宋内志贺菌分离株的耐药问题十分严重，对5类8种抗生素存在不同程度的耐药。有研究表明，我国志贺菌在1991-2000年间对氨苄西林、庆大霉素、复方新诺明和氯霉素的耐药率分别为53.0%、13.0%、62.0%和18.0%[4]。最近有研究显示，宋内志贺菌对这4种抗生素的耐药率有所增加[5-6]。从美国耐药监测网公布的2003-2012年志贺菌耐药情况看，其对庆大霉素和头孢曲松的耐药率均未超过1.1%，并且氨苄西林、四环素和复方新诺明的耐药性呈缓慢下降趋势[7-8]。本研究中，不同地区分离的暴发菌株对氨苄西林、庆大霉素、复方新诺明和氯霉素的耐药率分别为100.0%、100.0%、94.7%和0。因此需加强抗生素的规范使用和监测。
PFGE聚类分析显示，2014-2016年广东省的3起暴发分离株与广西壮族自治区柳州市2起暴发分离株的PFGE指纹图谱具有很高的相似度，提示暴发分离株之间的亲缘关系很近。广西壮族自治区柳州市散发分离株则比暴发分离株明显多出1个条带，并且散发分离株具有高度一致的PFGE指纹图谱，且散发菌株在分离时间和地点都比较分散，并无紧密关联性。总体来看，暴发分离株与散发分离株的PFGE指纹图谱的相似度高达93.2%，提示暴发菌株和散发菌株之间具有相近的亲缘关系。每起菌痢暴发事件分离株之间具有完全一致的PFGE指纹图谱，而不同暴发事件分离株之间则又存在细微的差别，与流行病学调查结果相互印证，提示同一起暴发事件分离株具有同源性。此外，柳州市的1起宋内志贺菌暴发分离株与广东省汕头地区的宋内志贺菌暴发分离株以及广东省常规监测中分离到的散发分离株的PFGE指纹图谱完全一致，但没有流行病学调查提示这2起暴发之间有任何的关联，以及散发分离株与暴发分离株之间的联系。因此，PFGE仅反映了病原菌基因组的局部遗传信息，在识别遗传特征相近的菌株时分辨率有限，要精确区分这类菌株之间的遗传关系，需要借助更高分辨率的分型方法。
与其他国家和地区的宋内志贺菌株相比，中国广东省和广西壮族自治区柳州市的6株宋内志贺菌代表株均处于同一个分支上，与来自韩国1998年和1999年分离的菌株亲缘关系最为接近。同时，本次分析的菌株又可进一步分为多个不同的小分支，提示2014-2016年广东省和广西壮族自治区柳州市发生的5起宋内志贺菌暴发是由不同的克隆株引起的。从本研究也可以看出，通过全基因组测序分析，不仅可以准确地鉴定出菌株携带的全部耐药基因和毒力基因，还可将具有一致或高度相似的PFGE指纹图谱的分离株通过wg-SNPs分析进一步区分开，提示基于基因组的wg-SNPs分析具有很高的分辨率，可用于菌株的精确溯源和暴发识别。
利益冲突: 无
| [1] | Chang ZL, Lu ST, Chen LH, et al. Causative species and serotypes of shigellosis in mainland China:systematic review and Meta-analysis[J]. PLoS One, 2012, 7(12): e52515. DOI:10.1371/journal.pone.0052515 |
| [2] | Zankari E, Hasman H, Cosentino S, et al. Identification of acquired antimicrobial resistance genes[J]. J Antimicrob Chemother, 2012, 67(11): 2640–2644. DOI:10.1093/jac/dks261 |
| [3] | Gardner SN, Slezak T, Hall BG. kSNP 3.0:SNP detection and phylogenetic analysis of genomes without genome alignment or reference genomes[J]. Bioinformatics, 2015, 31(17): 2877–2878. DOI:10.1093/bioinformatics/btv271 |
| [4] | Wang XY, Tao FB, Xiao DL, et al. Trend and disease burden of bacillary dysentery in China (1991-2000)[J]. Bull World Health Organ, 2006, 84(7): 561–568. DOI:10.2471/BLT.05.023853 |
| [5] |
赵嘉咏, 张白帆, 穆玉姣, 等.
河南省2011-2014年D群宋内志贺菌病原学监测与分子流行病学研究[J]. 中华流行病学杂志, 2016, 37(4): 558–562.
Zhao JY, Zhang BF, Mu YJ, et al. Surveillance on the etiology and molecular epidemiology of Shigella sonnei isolated in Henan province from 2011 to 2014[J]. Chin J Epidemiol, 2016, 37(4): 558–562. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2016.04.024 |
| [6] |
黄一灵, 黄珮珺, 张洁心, 等.
2007至2011年江苏地区宋内志贺菌整合子流行及耐药机制的研究[J]. 中华检验医学杂志, 2015, 38(8): 570–572.
Huang YL, Huang PJ, Zhang JX, et al. Study on the integron and antibiotic resisitance of Shigella sonnei isolated in Jiangsu province from 2007 to 2011[J]. Chin J Lab Med, 2015, 38(8): 570–572. DOI:10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2015.08.016 |
| [7] | Shiferaw B, Solghan S, Palmer A, et al. Antimicrobial susceptibility patterns of Shigella isolates in Foodborne Diseases Active Surveillance Network (FoodNet) sites, 2000-2010[J]. Clin Infect Dis, 2012, 54Suppl 5: S458–463. DOI:10.1093/cid/cis230 |
| [8] | NARMS. Human isolates final report, 2012[R]. Atlanta, Georgia:US Department of Health and Human Services, 2014. |