特发性肺间质纤维化是一种特殊类型、不明原因的慢性、进行性、纤维化性间质性肺炎，患者主要表现为进行性呼吸困难，伴刺激性干咳，进而发展为低氧血症和呼吸衰竭，最终导致死亡^[1]。特发性肺间质纤维化的早期诊断较难，诊断主要依赖胸部高分辨电子计算机断层扫描（CT）和（或）肺活检组织病理学^[1]，这些方法存在敏感度低、创伤性大的缺点。而生物标志物作为一类反映机体健康或疾病状态的特殊物质，测定方便。因此，寻找新的特发性肺间质纤维化相关的分子标记物对开展早期诊断十分必要^[2]。蛋白质组学是通过大规模的蛋白分离，从整体的角度来分析生物过程中全部蛋白质的组成、表达、功能改变和相互作用的学科，在蛋白质水平上揭示蛋白功能与细胞生命活动的规律^[3]，从而作为诊断疾病或者判别预后的依据^[4]。同位素相对标记与绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）联合二维液相色谱-串联质谱（two-dimensional liquid chromatography/tandem mass spectrometry，2D-LC-MS/MS）技术是近年来应用最广泛的蛋白质组学定量技术^[5]，为解决低丰度蛋白的定性、定量研究问题提供了有效途径，已被应用于肿瘤、颅脑损伤、苯中毒等多种疾病的标志物的研究^[6]。本研究应用iTRAQ技术结合2D-LC-MS/MS技术对特发性肺间质纤维化患者血清蛋白质进行识别，对差异蛋白进行基因功能（GO）分析、KEGG通路富集分析，以初步探讨差异蛋白的功能。

1.研究对象：山东大学第二医院呼吸内科2014年10月至2015年10月收治的30例特发性肺间质纤维化患者，男性25例，女性5例，年龄为（63.15±9.8）岁，其中病情轻度9例、中度18例、重度3例。参照2011年特发性肺间质纤维化诊疗指南^[1]进行诊断，临床表现为以劳力性呼吸困难并进行性加重，伴咳嗽、气喘或黏液脓性痰或脓痰等；胸部高分辨CT显示肺部出现弥漫性网状、结节状或毛玻璃样影等；肺功能显示限制性通气功能障碍和（或）弥散性功能障碍；病情程度根据肺功能肺总量及一氧化碳弥散量进行划分：轻（肺总量或一氧化碳弥散量＞60%）、中（肺总量或一氧化碳弥散量40%~60%）、重（肺总量或一氧化碳弥散量＜40%或无法完成肺功能检测）。排除已知原因的弥漫性间质性肺疾病等。对照组：30名健康体检者，男性25名，女性5名，年龄为（64.15±9.35）岁。病例组与对照组均无严重心肺功能不全，肝肾功能正常，无活动性疾病或影响血清蛋白质含量的其他相关疾病，无肿瘤病史。病例组与对照组性别、年龄等一般资料组间比较差异无统计学意义。所有研究对象均签署知情同意书，实验经过获得山东大学第二医院伦理委员会审批（KYLL-2013-025）。

2.研究方法：

（1）血清蛋白提取及定量：将采集的抗凝血在4 ℃条件下离心10 min，收集上清，分装后置-80 ℃冰箱保存。将30例特发性肺间质纤维化患者血清随机10份等量混合为1组，共3组；健康人血清也按同样方法混合为3组，每组血清标本各取400 μl，按照去血清高丰度蛋白提取试剂盒（美国Sigma公司）说明书进行操作，提取血清蛋白，-80 ℃保存备用。按照BCA定量试剂盒（美国Sigma公司）说明书进行蛋白定量。

（2）蛋白酶解、iTRAQ标记及肽段分离检测：每组样品各取200 μg蛋白，加入还原剂，37 ℃酶解过夜。根据iTRAQ试剂（美国Applied Biosystems公司）说明书对样品进行标记。将标记后的样品加入强阳离子交换柱进行肽段分离，之后用二维液相色谱-串联质谱法对肽段进行鉴定。

（3）质谱分析、差异蛋白筛选：分离后的肽段直接进入质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测。采用ProteinPilot^TM5.0软件（美国Applied Biosystems公司），下载UniProt_HUMAN蛋白质数据库，对质谱的原始数据进行比对分析，设置假阳性率＜5%，同时进行蛋白反库搜索，设置蛋白鉴定置信度＞95%，即unused score＞1.3的结果为可信蛋白。

3.生物信息学分析：利用GO数据库（ http://www.geneontology.org）对筛选到的差异蛋白按照生物学过程、细胞组成和分子功能3个方面进行注释和分类；利用KEGG pathway数据库，对差异蛋白参与的KEGG代谢通路进行注释和分类分析。

1.血清蛋白质的鉴定：iTRAQ共鉴定出490个可信蛋白。按照变异系数（CV）≤0.5且x≥1.5筛选后，得到重复性较好的上调蛋白共32个，按照CV≤0.5且x≤0.67筛选后，得到重复性较好的下调蛋白共58个，按照每组比值≥1.5或≤0.67的蛋白，筛选得到上调蛋白10个，下调蛋白22个，其中2种方法筛选到的共有上调蛋白4个，下调蛋白21个（表 1）。

表 1 特发性肺间质纤维化患者血清相关差异表达蛋白

表选项

2.生物信息学分析：GO分析显示，25个差异蛋白多数位于细胞外区域（92%）。对25个差异蛋白进行KEGG分类结果显示，9个差异蛋白参与了补体和凝血级联通路、血小板激活、ECM-受体相互作用等19条信号通路。补体和凝血级联通路包含FGA（sp|P02671|FIBA_HUMAN）、KLKB1（sp|P03952| KLKB1_HUMAN）、KNG1（sp|P01042|KNG1_ HUMAN）及PLG（sp|P00747|PLMN_HUMAN）4个差异蛋白。

特发性肺间质纤维化的发病率逐年升高，且致残率、病死率高，极具侵袭性^[1]。目前特发性肺间质纤维化缺乏有效的治疗措施，主要治疗方法为糖皮质激素和细胞毒类药物，但其效果欠佳^[7]，且毒副作用较大，患者耐受性较差。特发性肺间质纤维化患者预后差，一般生存期为确诊后的2~3年^[1]。

因此，进一步了解特发性肺间质纤维化的分子机制及寻找新的早期诊断标志物成为目前研究的热点。近年来，关于蛋白质组学的研究已在多个领域发挥着重要作用，是分析蛋白表达谱有力的工具^[8]。iTRAQ是美国应用生物系统公司在2004年推出的一项功能强大的多肽体外同位素标记技术，该技术采用4种或8种同位素编码的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团和串联质谱分析，可同时比较4种或8种样品中蛋白质的相对水平^[5]。

补体是免疫系统的重要组成部分，在机体天然防御、免疫调控中发挥重要作用^[9]。古兴宇等^[10]研究认为，特发性肺间质纤维化的病理发展可能与机体凝血级联反应产物有关。现就几个典型差异表达的炎症因子作相关描述。

C-反应蛋白是由肝脏合成的急性蛋白，正常人的血清C-反应蛋白水平较低，而在组织损伤和炎症时机体会大量分泌C-反应蛋白^[11]，研究表明C-反应蛋白与多种疾病相关，如慢性阻塞性肺病、肺癌、闭塞性细支气管炎和系统性红斑狼疮。本实验中结果显示C-反应蛋白在特发性肺间质纤维化患者的血清中升高最多（约16倍），暗示其可能作为生物标记物用于疾病诊断。

激肽原是一种多功能的单链糖蛋白，由激肽原基因编码，属于激肽释放酶激肽系统，分为低分子量激肽原和高分子量激肽原，主要由肝脏合成，它们分别行使不同的生物功能。激肽原有诱导炎症反应、参加生长因子、激素等的激活释放功能，在增生性肉芽肿^[12]、类风湿性关节炎^[13]等慢性炎症疾病中也有重要的作用。本研究提示，激肽原蛋白主要与补体和凝血级联途径有关，可以成为潜在特发性肺间质纤维化早期诊断标志物。

纤维蛋白原是一种主要由肝细胞合成分泌的糖蛋白，分别由3个独立的基因FGA、FGB、FGG编码^[14]。纤维蛋白原是急性时相蛋白，在感染或炎症等情况下分泌增加^[15]。本研究中质谱鉴定结果显示特发性肺间质纤维化组血清C-反应蛋白和FGA蛋白表达上调，激肽原表达下调，提示C-反应蛋白、FGA和激肽原可能与特发性肺间质纤维化的发生发展有关。

总之，本研究基于iTRAQ技术的蛋白质组学筛选血清特异性生物标志物，为特发性肺间质纤维化提供了广泛而实用的分子生物学信息。但这些蛋白在特发性肺间质纤维化发生发展中的作用尚未完全清楚，需要进一步评价这些血清差异蛋白作为早期诊断特发性肺间质纤维化的候选标志物的可靠性。