2018, Vol. 39
文章信息
- 宋颂, 付士红, 周兴余, 张佳珂, 李伟, 刘丽珺, 李劲松, 汪健, 林于, 李晓龙, 何英, 雷雯雯, 王环宇, 王斌, 鲁晓晴, 梁国栋.
- Song Song, Fu Shihong, Zhou Xingyu, Zhang Jiake, Li Wei, Liu Lijun, Li Jinsong, Wang Jian, Lin Yu, Li Xiaolong, He Ying, Lei Wenwen, Wang Huanyu, Wang Bin, Lu Xiaoqing, Liang Guodong.
- 四川省东南部地区蚊、蠓及相关虫媒病毒调查研究
- Mosquitoes, midges and related arboviruses in southeast Sichuan province
- 中华流行病学杂志, 2018, 39(10): 1381-1386
- Chinese Journal of Epidemiology, 2018, 39(10): 1381-1386
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2018.10.017
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文章历史
收稿日期: 2018-05-03
2. 102206 北京, 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所/传染病预防控制国家重点实验室;
3. 610041 成都, 四川省疾病预防控制中心;
4. 646000 泸州市疾病预防控制中心;
5. 646299 泸州市合江县疾病预防控制中心;
6. 644199 宜宾市南溪区疾病预防控制中心
2. State Key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
3. Sichuan Province Center for Disease Control and Prevention, Chengdu 610041, China;
4. Luzhou Municipal Center for Disease Control and Prevention, Luzhou 646000, China;
5. Hejiang County Center for Disease Control and Prevention, Hejiang 646299, China;
6. Nanxi District Center for Disease Control and Prevention, Yibin 644199, China
虫媒病毒是一类可以在蚊、蜱、蠓等吸血昆虫体内繁殖并通过叮咬将病毒传播给人类及动物的病毒[1]。虫媒病毒感染引起的症状主要表现为发热、皮疹、病毒性脑炎等，严重时可引起死亡[2]。1992年在国际虫媒病毒中心注册的虫媒病毒有535种，其中有128种可能与人畜疾病有关。四川省蚊虫种类较多。已经在四川省的蚊虫标本分离到盖塔病毒[3]、流行性乙型脑炎(乙脑)病毒[4-5]和布尼亚病毒目(Bunyavirales)的病毒等[6]。四川省是我国乙脑的高发地区，近年来发病率在2/10万~10/10万之间[7]。泸州、宜宾市位于四川省东南部，是四川省乙脑高流行区，自1950年代以来每年均有乙脑病例发生[8-9]。为此本研究2016、2017年连续2年在四川省泸州、宜宾市的3个县7个自然村开展虫媒病毒调查，以了解蚊、蠓以及其携带的虫媒病毒。
材料与方法1.标本采集：2016、2017年7月在四川省泸州市合江县大桥镇大桥村、大桥镇堰坎村、合江镇三块石村、合江镇柿子田村、榕山镇荆树村、古蔺县永乐镇龙井村、宜宾市南溪区留宾乡熊湾村共2市3县7个村庄采集蚊虫和蠓虫标本。采集地点为集中养殖的猪圈、村民散养猪圈、牛圈、鸡舍、鸭舍和兔舍。使用紫外诱蚊灯(武汉市吉星环保科技有限责任公司)于20：00至次日07：00左右在采集地点捕蚊。对采集的蚊虫和蠓虫标本在冰浴条件下进行形态学分类，按照采集环境和种类等信息(蚊虫50只/管，蠓虫500只/管)编号登记后立即放入液氮中保存备用。
2.病毒分离和鉴定：
(1) 细胞培养：BHK-21细胞(金黄色地鼠肾细胞)、C6/36细胞(白纹伊蚊细胞)为中国CDC病毒病预防控制所保存。BHK-21、C6/36细胞分别在37 ℃、5% CO2和28 ℃、5% CO2培养箱中培养[10]。
(2) 病毒培养：蚊虫及蠓虫使用Tissuelyser振荡器(德国Qiagen公司)振荡后经4 ℃、20 000×g离心20 min。取研磨上清液100 μl分别接种BHK-21细胞和C6/36细胞，分别放入37 ℃、5% CO2和28 ℃、5% CO2培养箱连续培养。每12 h在显微镜下观察细胞病变效应(CPE)，所有标本均盲传三代，出现CPE时收取后进一步进行鉴定[11]。
(3) 病毒RNA提取及cDNA制备：使用德国Qiagen公司提供的RNA提取试剂盒，根据说明书进行病毒RNA提取；使用第一链反应管，加入1 μl的pd(N)6完成cDNA的制备[12]。鉴定病毒使用的属特异性引物(黄病毒属、甲病毒属、布尼亚病毒属)和种特异性引物(乙脑病毒、环状病毒、辛德毕斯病毒、盖塔病毒、浓核病毒)来自文献[10]，扩增名称、产物大小等及阿卡斑病毒S、M片段引物[13]见表 1。综合考虑扩增目的片段长度、引物退火温度等信息，以引物的最适反应条件进行病毒基因的扩增。
(4) 病毒基因的PCR扩增：PCR反应条件参照文献[11]；取5 μl的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将测序结果进行Blast比对，确定病毒种类。
(5) 序列分析：使用BioEdit 7.0.5.3软件进行核苷酸序列拼接与质量分析、核苷酸多序列比对以及序列的同源性分析；使用MEGA 6.0软件完成基于Neighbour-joining方法的系统进化分析，Bootstrap值设定为1 000[11]。
结果1.一般情况：2016、2017年连续2年在四川省共采集到3属4种17 019只蚊虫，包括三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)、骚扰阿蚊(Armigeres subalbatus)及中华按蚊(Anopheles sinensis)，蠓虫12 700只(均为吸血库蠓)。从蚊虫的构成来看，三带喙库蚊最多(79.4%，13 519/17 019)，是当地的优势蚊种。其次为骚扰阿蚊，占11.1%(1 897/17 019)；标本采集信息见表 2。
2.病毒分离：2016年采集的蚊虫和蠓虫标本分167批处理(蚊虫151批次，蠓虫16批次)，2017年标本分为108批处理(蚊虫80批次，蠓虫28批次)。标本研磨和离心液分别接种BHK-21细胞和C6/36细胞，最终在2016年泸州市合江县榕山镇荆树村采集的3批蚊虫中获得3株病毒分离物(SCHJ1623、SCHJ1636、SCHJ1657)。3株病毒分离物在BHK-21表现为细胞聚集、圆缩、脱落。病毒株接种C6/36细胞主要表现为细胞脱落。3株分离物均来自2016年采集的3批三带喙库蚊中。所有蠓虫标本和2017年采集的蚊虫标本中未获得病毒分离物。病毒分离结果见表 3。
3.病毒序列分析：
(1) 乙脑病毒：对四川省采集的所有蚊虫和蠓虫标本进行多种属和种的特异性引物的病毒基因扩增，结果显示编号SCHJ1623、SCHJ1636、SCHJ1639、SCHJ1647、SCHJ1657、SCHJ1660、SCYB1604、SCHJ1721、SCHJ1725、SCHJ1741(SCHJ1623、SCHJ1636、SCHJ1657为病毒阳性分离物)在乙脑病毒巢式PCR获得目的条带，序列测定经Blast比对为基因Ⅰ型乙脑病毒(表 3)。使用乙脑病毒的E基因引物进行序列扩增，SCHJ1623、SCHJ1636、SCHJ1647、SCHJ1657、SCHJ1660获得目的条带，与GenBank中35株分离于不同国家或地区、不同基因型的乙脑病毒构建系统进化分析。结果显示5株乙脑病毒均为基因Ⅰ型。SCHJ1623、SCHJ1647与2008年中国台湾地区分离株TPC0806C亲缘关系最近，SCHJ1636、SCHJ1657、SCHJ1660在一个分支，与2006年河南省分离株HN06-26亲缘关系最近(图 1)。
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| 图 1 四川省乙脑病毒株E基因核苷酸序列的系统进化分析 |
病毒E基因核苷酸与氨基酸序列分析显示，4株乙脑病毒核苷酸序列同源性为97.3%~99.8%。其中SCHJ1623与病毒株TPC0806C核苷酸序列高度同源，核苷酸(氨基酸)序列同源性为99.3%(99.4%)。SCHJ1636与河南省分离株HN04-11同源性最高，核苷酸(氨基酸)序列同源性为98.3%(99.8%)。
(2) 阿卡斑病毒：2016、2017年在合江县采集的蠓虫标本中检测到4批(编号SCHJ1664、SCHJ1717-1、SCHJ1717-2、SCHJ1757)阿卡斑病毒基因扩增阳性。经核苷酸序列显示均为阿卡斑病毒。对4批阿卡斑病毒检测阳性标本进行阿卡斑病毒的S、M片段的基因序列扩增，SCHJ1664、SCHJ1717-1、SCHJ1717-2获得S片段编码区基因的序列，SCHJ1717-1获得M片段编码区基因的序列。将SCHJ1664、SCHJ1717-1、SCHJ1717-2病毒株与国内外分离到的25株阿卡斑病毒进行S片段序列的系统进化分析，结果显示病毒株SCHJ1664株与广西分离株GXLCH70N处于同一进化分支。病毒株SCHJ1717-1、SCHJ1717-2与云南省分离株DHL 10M110亲缘关系最近(图 2)。将阿卡斑病毒株SCHJ1717-1与国内外分离到的21株阿卡斑病毒以及布尼亚维拉病毒(Bunyamwera virus)为外群进行M片段序列的系统进化分析，结果显示病毒株SCHJ1717-1与广西壮族自治区分离病毒株GXLCH04亲缘关系较近(图 3)。
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| 图 2 四川省阿卡斑病毒株S片段核苷酸序列的系统进化分析 |
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| 图 3 四川省阿卡斑病毒株M片段核苷酸序列的系统进化分析 |
比较3株阿卡斑病毒的S片段基因的核苷酸(氨基酸)序列同源性，分析显示3株病毒株SCHJ1664、SCHJ1717-1、SCHJ1717-2之间的核苷酸(氨基酸)序列同源性在96.5%~99.4%(97.8%~99.6%)之间，SCHJ1664病毒株与GenBank下载的14株阿卡斑病毒(来自于肯尼亚、澳大利亚、韩国、日本、中国)进行核苷酸(氨基酸)序列的同源性分析比较，同源性在83.0%~99.4%(90.3%~99.6%)之间。病毒株SCHJ1664与2016年广西壮族自治区竹鼠分离毒株GXLCH70N同源性最高，核苷酸(氨基酸)序列同源性为99.4%(99.6%)。
将测序得到的阿卡斑病毒SCHJ1717-1的M片段的编码区序列与GenBank中的提供的14株阿卡斑病毒序列(分离自肯尼亚、澳大利亚、韩国、日本、中国)进行核苷酸(氨基酸)同源性比对，同源性在70.2%~96.9%(74.3%~98.0%)之间。病毒株SCHJ1717-1与中国分离株(GXLCH04、GXL CH70N、DHL10M110、NM/BS/1、CY-77)的核苷酸(氨基酸)序列的同源性在89.1%~96.8%(95.4%~97.9%)之间。
讨论王环宇等[14]在四川省东北部的巴中市采集的三带喙库蚊中分离3株乙脑病毒，张佳珂等[5]在四川省东部地区广安等7个县(区)进行虫媒调查，分离出8株乙脑病毒，均来自于三带喙库蚊。本研究在四川省东南部地区采集的三带喙库蚊中分离3株乙脑病毒和7批三带喙库蚊标本中乙脑病毒基因扩增阳性，提示四川省三带喙库蚊是当地乙脑病毒的主要传播媒介。7、8月是三带喙库蚊的高峰期，同时也是乙脑疫情的高发期，因此加强当地蚊虫媒介种类和密度监测及时发现蚊虫携带病毒及其相关疾病对当地公共卫生具有重要意义。
阿卡斑病毒属于布尼亚病毒目布尼亚病毒属病毒。阿卡斑病毒于1959年在日本采集的金色库蚊和三带喙库蚊中分离到[2]。在澳大利亚、马来西亚、南非、沙特阿拉伯、肯尼亚、韩国和我国台湾地区、云南省等地采集的媒介标本和动物标本分离到阿卡斑病毒[15-18]。1998年李其平等[19]在我国采集的蚊虫标本中分离到阿卡斑病毒，2010年从云南省采集的三带喙库蚊和迷糊按蚊(Anopheles vagas)分离到2株阿卡斑病毒(病毒株DHL10M117、DHL10M110)[20]。本研究在四川省采集的蠓虫中鉴定到阿卡斑病毒，进一步提示阿卡斑病毒通过蠓虫媒介携带。
由于在当地采集的蠓虫吸血量较多，细胞培养分离时血液可能对接种细胞产生毒性，导致研磨液在吸附过程中脱落或者发生细胞污染，为了避免这种情况，在蠓虫研磨时将双抗比例提高，使用0.22 μm的滤膜除菌滤过接种细胞，但是在蠓虫中未分离到阿卡斑病毒，使用剩余蠓虫研磨液进行病毒基因片段的扩增。虽然未获得阿卡斑病毒的阳性分离物，但是对采集的蠓虫标本进行分子生物学鉴定结果表明四川省采集的蠓虫中存在阿卡斑病毒。
利益冲突: 无
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