布鲁氏菌病（Brucellosis，布病）是由布鲁氏菌引起的一种严重危害人类和动物健康的人畜共患病。近年来，布病疫情在国内外均出现了回升的势头，有些布病罕见的地区报道的病例逐渐增多。海南省历史上少有病例报道，并非布病的流行区，只有1985年海南省防疫站在儋州市发现1例确诊病例^[1]，2009年底陵水县报告了全省近20年来首例布病确诊病例后，此后省内几乎每年均有病例报道^[1-2]，而2017年病例数明显增多，并多集中在东方市，布病防控形势严峻。本研究对2012－2017年分离的布鲁氏菌菌株进行鉴定，调查研究了海南地区布病流行规律和病原学特点，结合对东方市部分羊群进行检测，对相应疑似患者的流行病学特征进行分析，以期为本地区布病防控提供参考。

资料与方法

1.流行病学资料：收集2012－2017年在海南省人民医院诊断的16例布病患者的相关资料和病历，对患者基本情况、流行病学资料、实验诊断结果及患者的临床特征进行汇总分析。同时对疫区东方市布病患者饲养羊群采样检测布病抗体，了解同期采集羊血标本的布鲁氏菌分离结果。

2.主要仪器与试剂：BacT/Alert^® 3D全自动血培养仪（法国生物梅里埃公司），全自动细菌鉴定系统Vitek 2 compact VT2.R7.01细菌分析仪及配套细菌鉴定板GN卡（法国生物梅里埃公司），CO₂培养箱（中国上海HEAL FORCE公司），菌种保存管（中国北京友康恒业公司）。A、M单因子血清凝集试验、噬菌体裂解试验试剂由中国CDC馈赠。

3.布鲁氏菌的实验室鉴定：

（1）患者来源布鲁氏菌鉴定：16株布鲁氏菌分离自海南省人民医院就诊的患者血液样本，采集全血5~8 ml直接注入血培养瓶，置血培养仪中培养。依照我国WS 269－2007《布鲁氏菌病诊断标准》、血培养仪和Vitek 2 compact鉴定操作手册进行布鲁氏菌鉴定^[3]。布鲁氏菌初步鉴定：将血培养瓶中的样本转种血平皿，置35 ℃培养，初步判定参照陈东科等^[4]的方法。生化鉴定利用Vitek 2 compact鉴定功能，取生长48 h待检布鲁氏菌溶解于3 ml灭菌生理盐水中，并稀释为麦氏浊度0.50~0.63，用封口膜封口，将GN鉴定卡导管插入菌悬液中上机鉴定，鉴定完毕后及时将废弃物高压灭菌处理，并做好废物仓消毒灭菌。鉴定结果分析参照梅里埃（GN鉴定卡）布鲁氏菌属和种的生化阳性鉴定标准和参考菌株结果。传统生物学鉴定方法：包括标准阳性血清凝集试验，染料抑菌试验及噬菌体裂解试验，具体操作步骤遵照《布鲁氏菌病防治手册》^[5]。

（2）东方市羊血标本检测：对羊血清标本进行布鲁氏菌血清凝集（虎红和试管凝集）试验，由海南省CDC负责检测。羊血标本细菌的分离鉴定由中国动物卫生与流行病学中心进行检测。

结果 1. 布病患者的相关资料及流行病学特征

（1）性别、民族和职业分布：在16例患者中，12例为男性，4例为女性；均为汉族，职业以农民（养殖户）最多（8名），其次是工人（3名），其余为儿童、退休人员、无职业者。

（2）年龄分布：患者主要集中在31~62岁，15例成年人平均年龄为50岁，另1例为儿童（3岁7个月）。

（3）接触史和发病时间：11例羊种3型患者中，6例有明确的与羊接触史。5例猪种3型中，1例有明确与猪接触史，1例有与“布病”患者密切接触史。其余患者接触史不详。从发病后就诊时间来看，全年均可发病，多集中在3－8月（14例），与国内其他地区发病集中时间相似。发病后1个月内前来就诊人数最多（14名），2个月内就诊2名。

（4）临床表现及治疗史：16例患者均有不同程度的发热，均无典型波状热，多为不规则热型，部分患者表现为畏寒、多汗、头晕、头痛、乏力、纳差、肌肉酸痛等症状。3例患者血常规白细胞计数低，中性粒细胞比例有所下降，1例患者白细胞计数及中性粒细胞比例稍升高，其余患者血常规正常。16例患者中13例C-反应蛋白升高，其中1例达到100 mg/L以上，9例血沉升高。将患者感染布鲁氏菌的种型与临床症状及感染指标进行比较分析，发现两者之间无明显关系。2例患者入院前已确诊为布病，2例入院时考虑存在布病可能，另外12例在血培养结果报告前均未考虑布病可能。

16例患者中14例伴有其他类型的疾病，其中1例神经性布病患者为硬膜下血肿术后第3天出现发热，另有1例患者是因月经量增多入院后查出布鲁氏菌感染。15例患者入海南省人民医院前均有治疗史，其中1例患者曾给予多西环素、利福平及头孢哌酮舒巴坦抗感染治疗2 d，经治疗后不再发热，但患者血液仍可培养出布鲁氏菌。1例入海南省人民医院前未给予任何治疗。

（5）种型及地理分布：距2014年初临高县波莲镇2名患者感染猪种布鲁氏菌3型后，2017年相同的村再发生1例儿童猪种3型感染病例，提示该村可能存在猪种3型感染的家畜，亦或是猪种布鲁氏菌3型的疫源地。另外2例猪种3型分别位于万宁市北大镇及定安县龙河镇。11例羊种3型布病病例，有5例位于东方市，4例位于海口市秀英区，另外2例分别位于临高县及乐东县，提示海南省布病主要的致病菌及流行菌种是羊种3型和猪种3型。见表 1。

2. 患者来源布鲁氏菌的鉴定

（1）细菌学和生化功能鉴定：布鲁氏菌血培养仪上的生长曲线表现为迟缓期曲线较平坦，生长期曲线短，稳定期曲线平坦；培养阳性报警时间4~5 d。血及巧克力培养基上培养48 h可见针尖样菌落。菌落涂片镜下为革兰阴性短小球杆菌，呈“细沙状”，见图 1。培养72 h，菌落较前稍大，凸起、表面光滑、边缘整齐、不溶血，无色素，尿素酶强阳性（15 min快速阳性），氧化酶、触酶均为阳性，待检菌涂片经柯氏染色为阳性（红色），见图 2。16株菌均考虑为布鲁氏菌。

（2）Vitek 2 compact鉴定：12株菌被鉴定为羊种布鲁氏菌，4株被鉴定为人苍白杆菌。羊种布鲁氏菌的鉴定时间为7~8 h，人苍白杆菌鉴定时间为5~6 h。具体生化鉴定结果见表 2。

3.生物分型方法鉴定：11株为羊种布鲁氏菌3型，5株为猪种布鲁氏菌3型，结果由中国CDC传染病预防控制所布病室复核，见表 3。

4.东方市羊血标本布鲁氏菌检测：海南省CDC对东方市745份羊血清进行血清凝集试验，其中阳性47份（6.3%）。中国动物卫生与流行病学中心从采集羊血标本中培养分离到羊种布鲁氏菌3型。

讨论

布鲁氏菌感染患者临床表现多样，在鲜有病例的地方临床诊断困难，造成误诊。该菌是专性细胞内病原菌，一旦进入体内，能逃脱吞噬细胞的杀灭，普通抗生素无法杀灭该菌，确诊需细菌的分离培养或检出特异抗体。布鲁氏菌具有高度传染性，是引起实验室感染的主要病原菌之一^[6]。海南省少有单位开展快速血清检测项目，对疑似感染患者多以作血培养为主，将血培养作为金标准，依靠细菌生长特点来进行初步鉴定，由于血培养的时效性差，影响了患者的及时诊断治疗。海南地区各相关的医疗机构应推广开展布鲁氏菌快速血清检测项目。

Vitek 2 compact全自动微生物鉴定系统简单、方便、快速，从样本培养到布鲁氏菌鉴定约需5~10 d可完成，既可用于大部分临床菌株的鉴定，还可以鉴定出绝大部分布鲁氏菌。可准确鉴定到属，但在种型方面的分辨率尚不理想，部分菌株可出现鉴定错误或无法鉴定的情况。本研究16株有4株被鉴定为人苍白杆菌。经典鉴定方法4株被鉴定为人苍白杆菌的菌株均为猪种布鲁氏菌3型，猪种布鲁氏菌其生化反应可能与人苍白杆菌非常相似，易发生误判。并且目前本实验室所用的细菌鉴定仪器数据库无猪种布鲁氏菌也是造成错误的重要原因^[7]。本实验室的鉴定结果与肖春霞等^[8]的鉴定结果（127株地方菌株中，121株被鉴定为羊种布鲁氏菌，4株被鉴定为人苍白杆菌）较为相似。

传统生物学分型方法是布鲁氏菌经典的菌种鉴定和生物型鉴定的依据，具有成本低廉、分辨率高、重复性好、分型能力强、结果易解释等特点，是布鲁氏菌生物种型鉴定的金标准。目前各种分子生物学分型方法快速发展，但是尚未取代传统的经典分型方法。

海南省畜牧业以生猪养殖为主，辅以牛、羊产业，农村居民多为生猪散养户。许多农村卫生环境较差，猪粪、羊粪随地排放，这可能是农民感染布病的主要途径。参考已有文献^[1-2]，结合本研究中临床布病病例及东方市羊血标本分离到羊种布鲁氏菌3型，提示该地区传染途径可能为羊传染到人。海南省布病主要的致病菌及流行菌种是羊种3型和猪种3型，这与国内以羊种菌为主要流行菌种不同。一般来说羊种菌毒力最强，猪种和牛种次之，但是海南省近几年发现的布病患者两个种型其临床表现并无明显差异，这与已报道的文献是有差异的。提示海南省布病患者及布鲁氏菌具有自己的特点。

纵观16例布病患者的时间、地理及种型分布，本研究结果显示，2009－2017年海南省布鲁氏菌患者以散发性分布为主要特征，且均未从相关家畜得到传染源的证实。而2017年布病病例忽然增多，根据中国CDC疫情报告网络数据，全省全年报告30例新发布病病例，其中在东方市报告发病20例，发病率为5.05/10万，从患者饲养的羊血标本检测到血清学阳性，从东方市羊血标本分离出布鲁氏菌，提示东方市已经发生由当地的传染源疫畜引起的人感染布病的疫情，海南省布病防控形势已经与全国一样严峻，应在海南省内特别是东方市加强布病防治知识的宣传。医护人员及微生物工作人员也应加强布病诊断知识的培训，不断提高业务水平和识别能力，避免患者的漏诊、误诊。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

志谢 感谢中国动物卫生与流行病学中心范伟兴主任、狄栋栋老师、中国CDC传染病预防控制所布病室及海南省CDC相关老师对论文的帮助