小肠结肠炎耶尔森菌是一种重要的食源性致病菌^[1]。人通过直接或间接接触受污染的流通食品导致急性腹泻或结缔组织并发症^[2-3]。小肠结肠炎耶尔森菌引起的食源性疾病在全球范围内日益增多，无论是典型的暴发或是散发都对公众健康造成严重的危害^[4-6]。为了解小肠结肠炎耶尔森菌在上海市浦东新区流通食品中的分布特征、耐药表型特征和分子型别，从2012年起主动开展4类流通生鲜食品的连续性基线监测，为建立食源性致病菌主动监测网络和食品安全风险评估及科学防控提供决策依据。

对象与方法

1.样品采集：根据上海市浦东新区人口分布和经济水平，选取城区、城乡结合区、郊区9家农贸市场和9家超市作为监测点。2012年4月至2016年12月，每月定期定点随机采集生鲜食品共3 900份：包括水产品1 488份（海水鱼、海水介壳、海水软体、淡水介壳），畜类制品1 074份（猪肉、羊肉、牛肉等），禽类制品590份（鸡肉、鸭肉、鸡肝等）和蔬菜748份（黄瓜、豆芽、菠菜等）。每份食品采样量＞250 g，当天送达实验室检测。

2.主要试剂和仪器：改良磷酸盐缓冲液（PBS）、改良克氏双糖管和动力培养基（中国上海华康生物有限公司）；耶尔森菌选择性琼脂平板（CIN）（中国上海科玛嘉微生物技术有限公司）；系统生化鉴定条API20E（法国生物梅里埃公司），5种小肠结肠炎耶尔森菌O抗原分型诊断血清（O : 1，2、O : 3、O : 5、O : 8、O : 9）（日本生研公司）；生物分型试剂（丹麦Rosco公司）；革兰阴性需氧菌药敏检测板（中国上海星佰生物技术有限公司）；毒力基因多重PCR试剂盒（中国北京卓诚惠生生物科技股份有限公司）；限制性内切酶NotⅠ、XbaⅠ（日本TaKaRa公司）；SeaKem Gold Agarose（美国Lonza公司）；全自动药敏试验菌液接种仪（美国赛默飞公司）；脉冲场凝胶电泳仪及成像系统（美国伯乐公司）；毛细管电泳仪（德国Qiagen公司）。

3.分离培养与鉴定：参照文献[7]。取25 g样品均质后加入225 ml PBS，置4 ℃增菌，于第7、14、21天，吸取0.5 ml经碱处理后划线接种CIN，置26 ℃培养24 h，挑取3~5个可疑菌落接种改良克氏双糖管和动力培养基进行初筛及后续系统生化鉴定。

4.表型鉴定：生化表型符合小肠结肠炎耶尔森菌者进行生物分型和血清分型^[8]；按照PCR试剂盒操作说明，扩增ail、ystA、ystB、yadA和virF基因，采用毛细管电泳仪进行产物分析。

5.药敏试验：参照2017年版美国临床实验室标准化委员会推荐的肉汤稀释法和判断标准^[9]，测试分离株对氨苄西林（AMP）、阿莫西林-克拉维酸（AMC）、氨苄西林-舒巴坦（AMS）、头孢西丁（CFX）、头孢噻肟（CTX）、头孢他啶（CAZ）、头孢吡肟（FEP）、庆大霉素（GEN）、阿米卡星（AMI）、卡那霉素（KAN）、萘啶酸（NAL）、环丙沙星（CIP）、左氧氟沙星（LEV）、多粘菌素B（PB）、多粘菌素E（CT）、亚胺培南（IPM）、美罗培南（MEM）、四环素（TET）、米诺环素（MIN）、多西环素（DOX）、复方新诺明（SXT）、氯霉素（CHL）、氨曲南（AZM）11类23种抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。质控菌株为大肠埃希菌（ATCC25922）和肺炎克雷伯菌（ATCC700603）。

6.分子分型：参照2017年国家致病菌识别网中小肠结肠炎耶尔森菌PFGE标准化方法^[10]，选用限制性内切酶NotⅠ对47株O : 8血清型和18株O : 5血清型菌株进行酶切分型。电泳参数：脉冲时间为2~20 s，电泳时间为18 h。分子量标为布伦登卢普沙门菌（H9812）。使用BioNumerics 5.10软件对电泳图谱进行聚类分析。聚类算法为非加权配对平均法（UPGMA），电泳条带优化度为1.5%，相似度为100.0%。

7.统计学分析：使用Excel 2007软件进行数据处理、SPSS 16.0软件进行统计学分析，率的比较使用χ²检验和Fisher’s确切概率法，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.一般情况：3 900份生鲜食品中有111份（2.8%）检出小肠结肠炎耶尔森菌。不同食品小肠结肠炎耶尔森菌检出率从高到低分别为禽类制品（5.3%，31/590）、畜类制品（4.5%，48/1 074）、水产品（1.6%，24/1 488）和蔬菜（1.1%，8/748），不同食品检出率差异有统计学意义（χ²＝39.3，P＜0.001）。不同食品小肠结肠炎耶尔森菌检出率不具有明显的季节特征。见图 1。

2.表型特征：111株菌株中包括生物1A型106株（95.5%），生物2型5株。O : 8血清型47株（42.3%），O : 5血清型18株（16.2%），O : 3血清型1株，O : 1，2血清型1株，未定型44株，O : 8血清型菌株分离数与年总分离数呈正相关，见图 2。所有菌株均缺失ail、ystA、yadA和virF基因，76株ystB基因阳性（68.5%）。1A/O : 8/ystB为优势型别（31.5%），其次为1A/O : 5/ystB（12.6%）。1A/O : 8/ystB型别以畜类制品（12株）和水产品（12株）为主，1A/O : 5/ystB型别以禽类制品（6株）和畜类制品（6株）为主。

3.耐药性特征：111株菌株对AMP和AMC耐药率较高，分别为74.8%和70.3%，其次为NAL和CFX，分别为27.0%和14.4%。经趋势χ²检验，不同年份菌株对4种抗菌药物耐药率无下降趋势（P＞0.05），见图 3。对SXT、AMS、TET耐药率在1.8%~8.1%，未发现对其他16种抗菌药物产生耐药性的菌株。对CFX、AMS、AMP和AMC中介耐药率较高，为15.3%~43.2%，对CFX不敏感率超过50.0%。43株菌株为耐≥3类抗菌药物的多重耐药株，多重耐药率为38.7%（43/111），见表 1。

4.分子分型：47株O : 8血清型菌株可分为44种PFGE型别，不同来源菌株间遗传相似度在59.2%~100.0%，呈多样性。3株水产品分离株（海水介壳和海水鱼）具有相同的分子型别，其中同一摊位不同进货来源的1株海水介壳和1株海水鱼分离株毒力基因型和耐药谱一致。1株猪肾和1株鸡肉分离株具有相同的分子型别，但毒力基因型和耐药谱不完全一致。2株生物2型的菌株遗传相似度为76.6%，耐药谱差异较大。见图 4。18株O : 5血清型菌株可分为18种PFGE型别，菌株间遗传相似度在61.5%~87.2%。不同型别菌株毒力基因型相似度较高，但耐药谱有一定差异。见图 5。

讨论

小肠结肠炎耶尔森菌具有嗜冷性特点，低温条件下仍能繁殖并产生毒素导致食源性疾病（冰箱病），由其引起的耶尔森菌病在欧洲地区是排位第三的常见人畜共患病^[11]。我国报道的2次食物中毒事件均是患者食用受污染食品所致^[12]，并且不同食品分离株的型别和致病力也存在差异^[13-14]。因此了解食品中小肠结肠炎耶尔森菌病原学及分子流行病学特征对公众健康具有特别重要的意义。

本研究结果显示，食源性小肠结肠炎耶尔森菌检出率为2.8%，与我国南方地区同类食品检出率（2.03%）相似^[15]。禽类制品和畜类制品检出率最高，与我国北方4个省份的研究结果一致^[16]，提示禽畜类制品是食源性小肠结肠炎耶尔森菌的重要暴露风险因素，今后应加强此类食品的监测工作，增加监测种类、数量和频率，确保食物供应链的安全。

东南亚和欧洲地区的研究结果表明，食源性小肠结肠炎耶尔森菌以3/O : 3型和4/O : 3为主，不携带ystB基因^{[14, 17]}，此类菌株通常携带位于染色体的毒力基因（ail、ystA）和致病性质粒pYV，属于传统意义上的致病性小肠结肠炎耶尔森菌，也是全球主要的腹泻菌株型别^[4-5]。本研究结果显示，食源性小肠结肠炎耶尔森菌以1A/O : 8/ystB型为主，未检出致病性小肠结肠炎耶尔森菌，与国外研究结果不同，推测与采集的食品类型不同和地区性差异有关。由于缺乏产毒株标记的毒力基因，1A/O : 8/ystB型菌株通常被认为是非致病性的，但国外研究表明，生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌携带的ystB基因与致病性菌株携带的ystA基因高度同源，对乳鼠具有致病性，纯化的YstIB肠毒素（0.4 pmol）最低有效剂量（MED）远低于YstIA肠毒素（7.6 pmol），证明其具有潜在的致病力^[18]。此外，芬兰腹泻患者的病例对照研究显示，大多数分离的小肠结肠炎耶尔森菌属于生物1A型^[19]。因此，有必要对此类菌株进行持续性监测和进一步研究。

有研究表明，小肠结肠炎耶尔森菌产生两种β-内酰胺酶（BlaA和BlaB），能水解多种青霉素和头孢菌素^[20]。本研究结果同样显示，分离株对青霉素类抗菌药物处于高水平耐药。对NAL耐药率为27.0%，与广州地区研究结果一致（29.3%）^[15]。本研究中CFX耐药率（14.4%）低于Peng等^[16]研究结果（61.5%），但超过50%菌株对CFX表现为不敏感，可能与不同养殖场抗菌药物使用情况不同有关。

本研究结果显示，食源性小肠结肠炎耶尔森菌对绝大部分抗菌药物耐药率较低，但仍有38.7%的菌株表现为多重耐药，提示畜牧养殖业应加强抗菌药物管控，降低多重耐药菌株的比例，防止超级耐药细菌的发生。本研究为掌握上海市浦东新区食源性小肠结肠炎耶尔森菌耐药基线水平和长期的耐药性监测提供了科学依据。

作为细菌分子分型的金标准，PFGE分型通过分析菌株间相互关系以及遗传变异特征，为流行病学调查提供方法和证据^[21]。本研究结果显示，不同来源菌株间相似度较低，聚类关系不明显，无优势型别，呈多样性。生物/血清型、毒力基因型和耐药表型与聚类结果较难建立很好的相关性，与我国对禽肉及德国对猪肉的相关研究结果一致^{[16, 22]}，提示上海市浦东新区食源性小肠结肠炎耶尔森菌存在多种遗传克隆，其分布和数量较均等。同一摊位不同进货来源的食品分离株具有相同的分子型别、毒力基因型和耐药表型特征，提示在食品储存、销售环节之间存在交叉污染的可能。本研究对象主要为销售场所食品，但未对食品养殖/种植、屠宰、加工、运输等环节开展相关监测和研究，尚不能完整的揭示小肠结肠炎耶尔森菌在各环节中污染情况及特征。

综上所述，本研究系统性地对上海市浦东新区食品销售流通环节不同生鲜食品持续性监测和研究，获得本地区小肠结肠炎耶尔森菌的耐药及分子流行病学特征，为下一步扩大监测对象和范围提供理论依据。持续开展从动植物养殖到流通环节的一系列监测，逐步建立基于多部门的流行病学和病原学综合监测平台，不断完善食源性致病菌大数据，对食品安全风险评估和疾病暴发预警具有重要意义。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突