胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率分别为29.3/10万、21.2/10万^[1]。内窥镜检查及活检组织病理学诊断是目前常用的胃癌早期筛查手段^[2]。但该方法为侵入性、对操作者技术水平要求较高，难以在大规模社区人群中广泛开展^[3]。因此，寻找有效、简便、非侵入性的外周血胃癌相关标志物，对胃癌早诊筛查具有重要意义。近年来，胃癌相关外周血标志物研究涉及DNA、蛋白质、RNA等^[4-5]。其中，环状RNA具有高度保守性和较长的半衰期，可能与肿瘤的发生发展相关。既往研究提示，hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096和hsa_circ_0001895表达水平ΔCt值在胃癌中高于癌旁组织（13.0 vs. 12.5、13.5 vs. 12.6、12.0 vs. 9.8，P＜0.05）；且胃癌患者血浆hsa_circ_002059水平可在术后出现显著变化^[6-8]。本研究以山东省临朐县胃癌高发区人群为基础，采用病例对照研究设计，定量分析血清候选环状RNA表达水平与胃癌的关系，初步探索其作为胃癌相关非侵入性标志物的潜在应用价值。

对象与方法

1.研究对象：山东省临朐县是我国北方的胃癌高发区之一，本课题组自1989年起在临朐县开展了多项胃癌相关流行病学研究^[9]。此外，自2008年开始，临朐县承担“中央转移支付胃癌筛查和早诊早治项目”（早诊早治项目），每年在该地区采用整群抽样的方法对1 500~2 000名40~69岁常住居民进行胃镜筛查和胃癌早诊早治。本研究利用2012年1月至2014年12月在临朐县人民医院就诊的胃癌患者，选择首次经临床病理学确诊、未接受任何手术治疗、放疗或化疗的胃癌病例48例。在同期参加早诊早治项目，接受胃镜筛查、病理学诊断为正常胃黏膜或浅表性胃炎的病例中，根据年龄（±2岁）、性别进行1:1匹配，选择48例对照。全部研究对象均在接受胃镜检查及病理诊断的同时进行体格检查及问卷调查，收集外周血样本和详细的人口学资料。本研究经北京大学肿瘤医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

2.幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，HP）感染状况检测：采用ELISA检测血清HP IgG抗体^[10-11]，具体步骤如下：用抗原稀释液（10 μl/ml）包埋酶标板过夜，每孔100 μl。用PBSTTG液封闭酶标板，37 ℃保温3 h，PBS缓冲液洗3次。待测血清样品以1:800倍稀释，每孔加入100 μl，37 ℃保温1 h，PBS缓冲液洗3次；每孔加入结合过氧化氢酶的羊抗人IgG的二抗100 μl（英国Abcam公司），37 ℃保温1 h，PBS缓冲液洗3次；每孔加入100 μl新配制的显色液，15 min后415 nm波长下比色；每块板带有阴性对照和阳性对照，每个样品做2孔平行样，每批样品重复一次，实验误差＜10%。IgG平均的光密度值≥1.0确定为HP感染阳性。

3.实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测血清环状RNA表达水平：根据miRNeasy Serum/Plasma Kit试剂盒说明书（德国Qiagen公司），提取研究对象血清中总RNA。进一步参照GoScript Reverse Transcription System（美国Promega公司）试剂盒说明书反转录合成cDNA。并采用qRT-PCR方法检测胃癌和对照血清中候选环状RNA（hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096和hsa_circ_0001895）表达水平。引物序列引自参考文献[6-8]。PCR扩增条件：95.0 ℃ 15 s，60.2 ℃（hsa_circ_002059）或62.0 ℃（hsa_circ_0000096和hsa_circ_0001895）30 s，72 ℃ 30 s，45个循环。采用2^-ΔΔCt方法对环状RNA表达水平进行相对定量。以GADPH基因作为内源性参照，全部研究对象血清混合液作为阳性参照，同时以无RNA酶水作为阴性对照。采用如下公式对待测样品血清中候选环状RNA表达百分比（2^-ΔΔCt）进行计算：

本研究首先根据候选环状RNA表达百分比（2^-ΔΔCt）是否＞0，将血清样本定义为环状RNA表达阳性和阴性，分析表达阳性率与胃癌的关系。此外，由于本研究的对照来自临朐县整群抽样的早诊早治项目中胃镜筛查、病理确诊的正常胃黏膜及浅表性胃炎病例，可初步反映该地区正常及轻度胃黏膜病变病例血清候选环状RNA的水平。同时，参照既往qRT-PCR定量分析文献[12-13]，根据对照组中候选环状RNA（hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096、hsa_ circ_0001895）表达水平M，进一步将3个候选环状RNA表达水平划分为低表达或阴性表达和高表达或阳性表达组，分析环状RNA表达状态与胃癌的关系。

4.统计学分析：采用配对t检验比较胃癌组与对照组间年龄分布差异，采用McNemar检验比较分类变量如性别、吸烟、饮酒和HP感染状态在两组间的分布。候选环状RNA表达水平在两组间的比较采用Wilcoxon符号秩和检验进行单因素分析；采用条件logistic回归分析或非条件logistic回归分析进行多因素分析，调整吸烟、饮酒、HP感染状态，计算与胃癌关联强度的OR值及其95%CI。所有统计分析均由SPSS 24.0软件完成。双侧检验，检验水准α=0.05。

结果

1.基本情况：胃癌组与对照组年龄均为（58.5±7.8）岁，男性35例（72.9%），女性13例（27.1%）。胃癌组吸烟及饮酒者所占比例分别为52.1%和47.9%，对照组吸烟及饮酒比例分别为39.6%和58.3%，两组差异无统计学意义（P=0.263和P=0.302）。HP感染阳性者在胃癌组所占比例（62.5%）与对照组（58.3%）差异无统计学意义（P=0.523）。见表 1。

2.血清候选环状RNA表达阳性率与胃癌的关系：胃癌病例血清中3个候选环状RNA（hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096、hsa_circ_0001895）表达阳性率分别为70.8%（34/48）、47.9%（23/48）和75.0%（36/48），略高于对照组中的58.3%（28/48）、31.3%（15/48）和60.4%（29/48），差异均无统计学意义，P值分别为0.327、0.152和0.167。胃癌组中hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096、hsa_circ_0001895表达水平M（P₂₅~P₇₅）分别为1.60%（0~5.64%）、0（0~0.61%）、0.91%（0.06%~1.88%）；对照组中分别为0.05%（0~6.07%）、0（0~0.34%）、0.42%（0~1.39%），两组表达水平差异无统计学意义（P值分别为0.692、0.210和0.105）。

根据对照组中hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096、hsa_circ_0001895表达水平中位数（0.05%、阴性、0.42%），本研究将3个候选环状RNA表达水平分为低表达或阴性表达组（≤0.05%、阴性、≤0.42%）与高表达或阳性表达组（＞0.05%、阳性、＞0.42%）进行分析，结果显示，胃癌组中hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096、hsa_circ_0001895高表达病例所占比例略高于对照组（62.5% vs. 50.0%、47.9% vs. 31.3%和70.8% vs. 50.0%）。多因素分析调整吸烟、饮酒和HP感染状况后发现，与对照组相比，hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096、hsa_circ_0001895高表达与胃癌之间的关联强度略有上升，OR值（95%CI）分别为1.39（0.73~2.64）、1.35（0.73~2.50）和1.64（0.85~3.14），但差异无统计学意义（P值分别为0.320、0.336和0.139）。见表 2。

3.候选环状RNA表达状态影响因素分析：对年龄、性别、吸烟、饮酒、HP感染状况与hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096和hsa_circ_0001895表达的关系进行分析。结果显示，年龄、性别、吸烟、饮酒、HP感染与血清环状RNA表达状态均无显著相关（均P＞0.05）。见表 3。

4. HP对环状RNA表达水平与胃癌关系的影响：在HP感染阴性和阳性病例中，hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096、hsa_circ_0001895高表达者所占比例均在胃癌组略高于对照组。调整吸烟、饮酒状况后的多因素分析结果显示，hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096、hsa_circ_0001895高表达与胃癌关联强度的OR值呈上升趋势，但差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表 4。

5.环状RNA表达与胃癌关系的联合分析：上述研究结果提示，血清hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096、hsa_circ_0001895表达水平在胃癌病例中均略高于对照组，因此本研究将3种候选环状RNA进行组合，对其与胃癌的关系进行联合分析，结果显示，同时表达2种或3种环状RNA的病例所占比例在胃癌组中略高于对照组（45.8% vs. 33.3%；27.1% vs. 18.8%）。非条件logistic回归调整吸烟、饮酒及HP感染状况后，分析结果显示，与3种候选环状RNA表达均为阴性者相比，环状RNA与胃癌之间关联强度的OR值由表达1个候选环状RNA的1.31，上升为表达2个候选环状RNA的2.74，和表达3个候选环状RNA的3.46。环状RNA与胃癌之间的关联强度随环状RNA表达阳性个数增加逐渐升高，趋势检验P=0.040。见表 5。

讨论

环状RNA是一类5′端和3′端以共价键结合形成的闭合环状RNA分子^[14]，其不易被核酸外切酶降解，可以稳定存在于体内。前期研究提示，环状RNA可能具有miRNA海绵作用^[15]，在调控基因转录、RNA结合蛋白、蛋白质翻译等生理、病理过程中发挥重要作用^[16-18]。此外，环状RNA可能参与多种肿瘤的发生发展^[19-20]，为肿瘤相关标志物研究提供新的方向。

近年来，有研究提示，环状RNA可能与胃癌密切相关，且外周血中环状RNA水平可能具有非侵入性标志物的应用潜力。然而，既往研究多采用癌旁组织作为对照，或比较胃癌手术前后血浆环状RNA表达水平^{[6-8, 21]}。本研究基于山东省临朐县胃癌高发区人群，对3种候选环状RNA（hsa_circ_002059、hsa_circ_0000096、hsa_circ_0001895）血清表达水平，在胃癌病例及严格根据年龄、性别匹配，胃镜活检病理学诊断为正常胃黏膜或浅表性胃炎的对照病例间进行比较，结果显示，胃癌病例血清中上述3种环状RNA表达水平有升高趋势，且随着表达阳性标志物个数的增加，其与胃癌的关联强度呈显著上升趋势。

既往曾有研究提示，胃癌发生的重要危险因素HP感染引起的慢性炎症能够诱导机体内LincRNA、microRNA等多种RNA分子表达失调^[22]。但本研究利用所有研究对象初步分析了年龄、性别、吸烟、饮酒及HP感染状况与血清候选环状RNA表达水平的关系，并未发现上述因素与血清环状RNA表达水平显著相关。

本研究存在局限性。胃癌病例及匹配对照的样本量较小，上述结果尚有待于进一步扩大样本量验证。此外，血清中环状RNA的来源与可能的作用机制也有待进一步的功能学研究阐明。

综上所述，本探索性研究为血清环状RNA作为潜在的非侵入性胃癌相关标志物研究提供了初步的流行病学线索。但是上述标志物是否可以作为胃癌早期筛查、早期诊断标志物尚需进一步扩大样本的前瞻性队列验证。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突