2021, Vol. 42
文章信息
- 曹蓝, 吴迪, 陈艺韵, 曾庆, 夏丹, 刘艳慧, 陆剑云, 李魁彪, 狄飚, 张周斌.
- Cao Lan, Wu Di, Chen Yiyun, Zeng Qing, Xia Dan, Liu Yanhui, Lu Jianyun, Li Kuibiao, Di Biao, Zhang Zhoubin
- 广州市2019年H3N2流感病毒分子流行特征分析
- Molecular-related epidemic characteristics of influenza A (H3N2) viruses in Guangzhou, 2019
- 中华流行病学杂志, 2021, 42(5): 891-897
- Chinese Journal of Epidemiology, 2021, 42(5): 891-897
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112338-20200724-00983
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文章历史
收稿日期: 2020-07-24
2. 广州市疾病预防控制中心传染病预防控制部 510440;
3. 广州市疾病预防控制中心 510440
2. Department of Infectious Diseases Prevention and Control, Guangzhou Center for Disease Control and Prevention, Guangzhou 510440, China;
3. Guangzhou Center for Disease Control and Prevention, Guangzhou 510440, China
近年来，新型3C.2a分支H3N2流感病毒突变株在全球范围出现，2015-2016年该分支病毒在我国出现，2017年夏季我国华南地区出现了3C.2a.1分支病毒，研究发现该分支病毒携带的N121K突变可以降低疫苗的有效性[1]。目前3C.2a分支H3N2流感病毒已经在欧洲、亚洲、北美洲广泛流行[2]。与H1N1流感病毒和B型流感病毒相比，H3N2流感病毒的抗原漂移频率更快[3]，因此，对3C.2a.1分支H3N2流感病毒进行持续的分子变异监测，对及时更新疫苗组分有着重要的公共卫生意义。本研究对2019年广州市不同来源的H3N2流感病毒进行测序和分析，掌握H3N2流感病毒的分子流行病学特征，为流感的科学防控提供参考依据。
材料与方法1. 标本来源：收集2019年1-12月广州市4家流感病原学监测哨点医院流感样病例的咽拭子标本、流感暴发疫情中的咽拭子标本以及疑似流感重症住院病例的呼吸道标本。流感样病例定义：体温≥38 ℃，有咳嗽或咽喉疼痛之一者。流感样病例暴发：在同一学校、同一机构内短时间出现异常增多（≥5例）的具有流行病学关联的流感样病例。标本采集后放入含3~4 ml采样液的采样管中，保存温度为2~8 ℃，并于2个工作日内运送至广州市CDC流感监测网络实验室。
2. 病毒分离：采用荧光定量RT-PCR方法检测进行流感A型和H3N2亚型流感病毒核酸检测（试剂盒购自德国QIAGEN公司，流感A型和H3N2亚型流感病毒荧光定量检测试剂盒购自江苏硕世生物科技有限公司）。取0.1 ml H3N2流感病毒阳性标本接种MDCK细胞，置37 ℃ 5% CO2培养箱中吸附1~2 h。吸出接种物，清洗细胞2遍，然后加入5%胎牛血清的DMEM病毒生长液于细胞板中，置33~35 ℃培养箱培养。每日观察细胞病变情况，当75%~100%的细胞出现病变时进行收获，通过血凝实验对病毒滴度进行测定。
3. 血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因测序：应用Oligo 6.0软件设计H3N2流感病毒HA、NA基因全长扩增引物，引物由广州天一辉远生物科技有限公司合成。通过RT-PCR方法扩增HA、NA基因，将阳性鉴定产物送至广州天一辉远生物科技有限公司，通过ABI3730进行病毒基因一代测序。
4. 分子特征分析：应用DNA Star 7.1软件进行HA、NA基因序列拼接和同源性分析，运用MegAlign分析组件比较抗原位点、受体结合位点、糖基化位点、耐药位点等重要蛋白位点的变异情况。
5. 遗传进化分析：在GISAID数据库中下载历年WHO推荐的北半球H3N2流感疫苗推荐株和不同进化分支代表株HA、NA基因作为参比序列，包括：A/Hong Kong/4801/2014、A/Singapore/INFIMH- 16-0019/2016、A/Switzerland/9715293/2013、A/Texas/50/2012、A/Perth/16/2009、A/Kansas/14/2017、A/Hong Kong/2671/2019、A/Hong Kong/3110/2017、A/Pennsylvania/28/2014、A/VICTORIA/506/2013、A/Samara/73/2013、A/Netherlands/525/2014、A/Ohio/02/2012、A/Stockholm/18/2011、A/Puerto Rico/36/2012、A/Madagascar/0648/2011、A/Montana/05/2011、A/Victoria/208/2009、A/Norway/1330/2010等。使用Mega 6.0软件绘制HA、NA基因进化树，参数设置为：Neighbor-joining法（参数设置为1 000 replications）及Maximum composite likelihood model比对核苷酸序列。
6. 统计学分析：采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，统计方法采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1. 基本情况：2019年广州市流感监测标本5 300份、暴发疫情标本5 241份、流感样重症病例标本191份，H3N2流感病毒阳性率分别为3.13%（166）、21.79%（1 142）、3.66%（7），H3N2总阳性率为12.25%（1 315/10 732），不同标本来源的阳性率差异有统计学意义（χ2=866.53，P=0.00）。总体上，2019年广州市H3N2流感表现为2个流行期，1-8月为流行小高峰，11-12月为流行大高峰，见图 1。H3N2流感病毒阳性率的性别差异有统计学意义（χ2=8.43，P=0.00），男性和女性分别为13.46%（703/5 221）和11.50%（510/4 435）；H3N2流感病毒阳性率在各年龄组的差异有统计学意义（χ2=648.06，P=0.00），0~、11~、≥71岁组的H3N2流感病毒阳性率分别为11.84%（452/3 818）、25.18%（665/2 641）和1.97%（9/457）。对36株H3N2流感病毒（流感监测毒株20株、暴发疫情毒株15株、重症病例毒株1株）进行测序，共获得32株病毒HA、NA基因全长序列（监测病例16株、暴发疫情病例15株、重症住院病例1株）。见表 1。
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| 图 1 2019年广州市H3N2流感病毒流行情况 |
2. 分子变异特征：与2020-2021年疫苗株A/Hong Kong/2671/2019相比，32株H3N2流感病毒HA、NA基因核苷酸同源性分别在98.2%~99.8%和93.8%~99.8%之间，与2019-2020年疫苗株A/Kansas/14/2017相比，32株H3N2流感病毒HA、NA基因核苷酸同源性分别在96.3%~96.9%和93.3%~98.7%之间。32株病毒抗原变异位点主要发生在128、138、198位，集中位于A和B抗原决定簇区域。与2018-2019年疫苗A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016相比，有21株病毒发生抗原漂移[4]，占65.63%。见表 2。与2020-2021疫苗株相比，NA蛋白抗原位点变异主要发生在339~347位。
HA蛋白受体结合位点变异显示，20株毒株（68.75%）分别发生P227A、T131K、K135T/A、F137S、D190 N变异，主要分布在前壁和后壁。糖基化位点分析显示，HA蛋白主要位于24、38、54、61、79、138、174、181、262、301和499位，与2020- 2021疫苗株一致，但部分毒株在142、149和563位增加3个糖基化位点，分别占34.00%、31.00%和6.25%，主要位于抗原决定簇A区。NA蛋白糖基化位点主要位于61、70、86、146、200、234、245、367位，个别毒株在61、245和367位出现变异缺失，分别占6.00%、6.00%和3.00%。NA蛋白耐药位点主要位于119、136、151、222、274、292、294位。本研究32株病毒均未出现NA抑制剂耐药位点的变异。
3. 遗传进化分析：所有来源的H3N2毒株位于3C.2a.1进化分支，根据流行时间和进化分支的特点，可将32株病毒进一步划分为Group 1~3共3个小进化分支，Group 1分支流行于2019年1-8月，Group 3分支流行于2019年11-12月，Group 2分支为介于Group 1和Group 3的进化过渡分支，其中Group 2分支与2020-2021疫苗株亲缘关系最近（图 2）。NA进化特征与HA基因总体上一致，也分为Group 1~3不同的小分支（图 3），并在Group 2分支和Group 3分支之间存在HA和NA基因的重组现象。
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注： 代表2020-2021疫苗株； 代表2019-2020疫苗株； 代表2018-2019疫苗株
图 2 广州市2019年H3N2流感病毒血凝素（HA）基因遗传进化树
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注：代表2020-2021疫苗株；代表2019-2020疫苗株；代表2018-2019疫苗株
图 3 广州市2019年H3N2流感病毒神经氨酸酶（NA）基因遗传进化树
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近年来，广州市流感呈现双峰流行，一般小高峰出现在5-7月，大高峰出现在11月至次年1月，表现为全年多种流感病毒型别共流行、交替出现的特点[5]。2019年广州市出现了范围较大的H3N2流感疫情的暴发流行，全年总阳性率为12.25%（1 315/10 732），为了研究广州市H3N2流感流行毒株的分子流行病学特征，为流感的科学防控提供研究数据，本研究对2019年不同来源的H3N2流感病毒进行了测序和分析。
本研究发现，2019年广州市H3N2流感病毒HA抗原位点变异主要发生A和B区，与2017年毒株的抗原变异位点不同[6]，NA抗原位点主要变异区与2017年相同（339~347位）[7]，2017与2019年H3N2流感病毒HA蛋白糖基化位点主要为11个，2019年毒株的受体结合位点变异发生在HA蛋白前壁和后壁，而2017年毒株只发生在HA蛋白前壁[6]。
本研究分别采集门诊流感样监测病例、暴发疫情病例和流感重症住院病例的呼吸道标本进行不同标本来源的H3N2流感病毒遗传进化分析，结果显示不同标本来源的H3N2流感病毒高度同源，亲缘关系相近，来源于同一进化起源，表明门诊流感样病例病原学监测可以为本地区流感疫情暴发和临床重症病例的病原学研究提供重要的提示和参考。根据2019年广州市H3N2流感的两个流行期，H3N2流感病毒在分子进化上可以分Group 1~3不同的进化分支，各分支有着明显的时间分布特点，提示2019年广州市H3N2流感病毒在持续进化，流行期Ⅱ的病毒由流行期Ⅰ的病毒进化而来。
通过与疫苗株抗原位点变异情况的比较，可以在病毒分子水平上间接评价疫苗的免疫效果以及推测流行株是否发生新的抗原漂移。目前2020-2021年疫苗株尚未投入使用，2019-2020年疫苗株属于3C.3a分支与我国南方地区流行株不匹配，且2018年广州市H3N2流感病毒未广泛流行，因此为研究广州市既往使用的疫苗对2019年H3N2流行株造成的免疫压力的影响，本研究将2019年广州市H3N2流行株与2018-2019年疫苗株（位于3C.2a.1分支，使用接种时间为2018年9月至2019年5月）进行抗原位点的变异比较分析，发现随着时间推移，广州市2019年流行株Group 1~3分支的抗原位点变异逐渐增多，Group 1抗原位点与疫苗株总体一致，Group 2分支出现A138S、T128A突变，Group 3分支同时出现A138S、T128A、S198P突变，Group 2~3分支内所有毒株出现了新的抗原漂移，提示在疫苗免疫压力下，广州市H3N2病毒在持续进化，并不断发生变异以致发生免疫逃逸。
总体上2020-2021疫苗株与Group 1~3分支毒株位于同一进化分支，推测该疫苗在接种期间（2020年9月至2021年5月）可对同期的H3N2流行株具有较好保护。但进一步分析发现，2020-2021疫苗株与Group 2分支亲缘关系最近，而与Group 3分支毒株相对较远，因此随着2019年11-12月携带有S198P抗原位点、F137S和D190N受体结合位点突变（相对于2020-2021疫苗株）的Group 3流行新分支的衍生，进一步提示在分子遗传水平上广州市H3N2流感病毒在持续进化。且随着流行的继续，Group 3分支病毒是否会成为优势毒株继续流行，并在此基础上增加新的抗原位点突变、进而出现相对于2020-2021疫苗株的抗原漂移，有待于进一步密切监测。
研究证实，H5N6、H9N2、H7N9等亚型流感病毒经常发生基因重组[8-10]。本研究发现，在流行期Ⅱ分离的2株暴发疫情毒株的HA基因位于Group 2分支，NA基因位于Group 3分支，提示Group 2和Group 3之间存在基因重组的现象，也表明Group 2和Group 3分支在流行期Ⅱ共同流行，重组时间可能发生在2019年11-12月。而Group 2分支部分毒株分离于流行期Ⅰ（2019年1-8月），同样提示存在Group 2、3毒株与Group 1毒株重组的风险，因此需要警惕H3N2流感可能会通过基因重组的方式发生对新疫苗株的免疫逃逸。
本研究结合H3N2流感病毒分子进化和流行病学特点，对广州市H3N2流感病毒的进化变异情况进行解析，发现在疫苗免疫压力下H3N2流感病毒存在快速进化变异现象，特别是发生了抗原位点的变异。流感病毒易于发生抗原漂移，特别是在疫苗的选择压力下，如何有效的对未来一段时间流感病毒的流行进行精准预测，有待于更多研究。
综上所述，2019年广州市H3N2流感病毒的遗传变异包括位点突变和基因重组。在疫苗免疫压力下H3N2流感病毒正在快速进化变异，抗原位点变异逐渐累积，进而出现新的抗原漂移。我国华南地区是H3N2流感病毒流行的重要地区[11]，每年的流感流行高峰正处于新疫苗接种前后，及时对H3N2流感病毒流行株进行变异监测，对评估疫苗有效性、预警本地区流感流行十分必要。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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