2021, Vol. 42
文章信息
- 薛恩慈, 王斯悦, 郑鸿尘, 王梦莹, 王雪珩, 陈曦, 江锦, 李静, 李楠, 周治波, 朱洪平, 吴涛.
- Xue Enci, Wang Siyue, Zheng Hongchen, Wang Mengying, Wang Xueheng, Chen Xi, Jiang Jin, Li Jing, Li Nan, Zhou Zhibo, Zhu Hongping, Wu Tao
- 非综合征型单纯腭裂遗传流行病学研究进展
- Progress in genetic epidemiology of non-syndromic cleft palate only
- 中华流行病学杂志, 2021, 42(6): 1133-1138
- Chinese Journal of Epidemiology, 2021, 42(6): 1133-1138
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112338-20200409-00545
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文章历史
收稿日期: 2020-04-09
2. 北京大学口腔医院儿科/颌面外科 100081
2. Department of Pediatrics/Department of Oral and Maxillofacial Surgery, School of Stomatology, Peking University, Beijing 100081, China
唇腭裂（oral clefts）是在胚胎发育过程中颌腭组织发育不全或发育受阻所导致的一组颌面部先天畸形[1]。根据解剖部位可将唇腭裂划分为单纯唇裂（cleft lip only，CLO），单纯腭裂（cleft palate only，CPO）以及唇裂伴腭裂（cleft lip with palate，CLP）[2]。通常因为胚胎起源和流行病学特征的相似性，将CLO和CLP合并称为唇裂伴或不伴腭裂（cleft lip with or without cleft palate，CL/P）[3]。CL/P的患病率高于CPO，CPO的总体患病率约为1/2 500活产儿，我国为0.26/1 000活产儿，男女性别比为1∶2[4]。此外，唇腭裂还可分为综合征型与非综合征型两类，非综合征型唇腭裂（non-syndromic oral clefts，NSOC）患儿不伴有其他畸形或异常，是受多基因影响的疾病。NSOC相对于综合征型更为常见，约70%的CL/P患者和50%的CPO患者为非综合征型。最近一项Meta分析结果显示我国NSOC患病率约为1.67/1 000（95%CI：1.53/1 000~1.82/1 000），其中非综合征型单纯腭裂（mon-syndromic cleft palate only，NSCPO）亚型患病率为0.27/1 000（95%CI：0.24/1 000~0.30/1 000）[5]。腭裂患者不仅有软组织畸形，大部分患者还可伴有不同程度的骨组织缺损和畸形，在吮吸、进食及语言等生理功能障碍方面比唇裂严重。NSCPO所造成的多种生理功能及心理障碍，特别是语言功能障碍和牙错乱，会对患者的日常生活、学习、工作带来不利影响。不仅如此，既往研究表明NSCPO会增加患者全死因死亡风险[6]。
唇组织和初级腭、次级腭有不同的发育起源，且CPO、CLO和CLP的表型也不相同，有研究证实NSOC的各个亚型可能有不同的遗传病因[7-8]。然而目前研究证据大多针对非综合征型唇裂伴或不伴腭裂（non-syndromic cleft lip with or without cleft palate，NSCL/P）这一混合亚型，NSCPO这一特定亚型的遗传病因在以往的探索中较少被单独研究。全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）是复杂疾病致病基因的高效定位方法。通过GWAS已经至少发现了43个与NSCL/P相关的位点达到了全基因组显著性（P < 5×10-8），而GWAS发现的NSCPO的遗传位点非常有限，其结果总结见表 1。因此，本文将对既往发现与NSCPO亚型相关的遗传病因发现进行综述，为后续开展病因学研究提供线索。
NSCPO患者存在明显的家族聚集性。双生子研究中发现同卵双生子的发病一致率高于异卵双生子，NSCPO的遗传度为90%[13]。挪威的一项研究表明[14]，有家族史的一级亲属发生NSCPO的风险是一般人群的56倍。另有研究显示[15]，这种风险会随着亲缘系数的降低而显著降低。目前对NSCPO遗传危险因素的探索研究主要包括：GWAS、候选基因验证研究、全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）、全外显子测序（whole exome sequencing，WES）、动物模型和功能实验等。本文将目前发现的与NSCPO相关联的遗传基因分为研究证据比较充分的候选基因、具备一定研究证据的候选基因和现有研究证据较少的候选基因3类，其结果见表 2。
1.研究证据比较充分的候选基因:这类基因现有的研究证据包括：GWAS和/或Meta分析研究发现其与NSCPO的发病风险显著关联；人群中有高质量的研究验证其阳性关联；有表达分析、动物模型等研究支持其生物学功能。此类候选基因有GRHL3和IRF6。
(1)果蝇头状因子3基因（grainyhead like transcription factor 3，GRHL3）:GRHL3位于染色体1p36.11，是果蝇头状因子基因家族的一员，所编码的转录因子在胚胎发育过程中能够发挥关键的调控作用[16]。Leslie等[10]2016年基于欧洲人群中78个NSCPO病例，1 700个正常对照以及165个NSCPO核心家系开展了GWAS，研究发现GRHL3的rs41268753（P=4.08×10-9）达到了全基因组显著水平。该研究亦报道了独立人群验证结果，在欧洲人群246个NSCPO患者/1 685个正常对照中进行验证，结果发现rs41265753（P=2.8×10-4）依然达到了校正后的显著性水平。荧光素酶活性实验中，rs41268753突变型GRHL3活性约为野生型的三分之一。斑马鱼胚胎实验结果显示rs41268753这一突变干扰了周皮的发育。这为rs41265753变异导致NSCPO发生的生物学机制提供了线索。2017年对Beaty等[9]和Leslie等[10]发表的GWAS结果进行Meta分析[11]，在NSCPO亚型分析中共纳入了78个NSCPO病例，1 700个正常对照以及616个NSCPO核心家系。结果显示，GRHL3的rs41268753经Meta分析后达到了全基因组显著水平。Eshete等[17]2018年对来自非洲3个国家134个NSCPO核心家系和270个正常对照的GRHL3进行外显子测序以识别可能的罕见变异，结果发现了5个在对照组和公开外显子数据库、全基因组数据库中均不存在的新发变异（2个错义突变、1个移码突变、1个无义突变、1个剪切位点）。2016年Mangold等[18]对69个NSCPO患者的GRHL3编码区进行测序，并将结果与公开数据库进行对比，结果发现18个常见变异和12个罕见变异，其中rs41268753的P值最显著。为了验证这一结果，在3个不同的病例对照研究中（47/187、94/177、51/94）进行测序并与2011年Beaty等[9]发表的GWAS数据合并进行Meta分析，结果发现rs41268753（P=2.73×10-9）达到了全基因组显著性。同时已有小鼠、斑马鱼等动物模型发现GRHL3与NSCPO等先天畸形有关[19-20]。
(2)干扰素调节因子6基因（interferon regulatory factor 6，IRF6）:IRF6位于染色体1q32.2，该基因编码干扰素调节转录因子（IRF）家族的一个成员。其变异与唇腭裂的关联已在多个研究中得到证实[21-23]。值得注意的是，近年来研究表明IRF6这一基因与NSCPO亚型也存在显著关联。2008年Rahimov等[24]发现IRF6上的rs2235371和rs642961组成的单体型与NSCL/P有关，并在亚型中进行验证，结果显示在大多数人群中该单体型对NSCPO和非综合征型单纯唇裂作用方向是相反的。2010年Nikopensius等[25]在104个NSCPO病例/606个正常对照中对GWAS及其他研究中发现的40个NSOC候选基因进行验证，研究发现IRF6（rs17389541）与NSCPO发生有关。2016年Yu等[8]对中国人群共计7 404名病例/16 059名正常对照进行GWAS，在验证阶段发现IRF6上的rs861020在NSCPO和NSCLO亚型的作用方向是相反的。2018年Gurramkonda等[26]对来源于印度人群的176名NSCPO病例/176名正常对照进行研究，发现IRF6内含子区域的rs2235375与NSCPO亚型有关而与NSCLO无关。2019年Huang等[7]在中国人群中通过多阶段的GWAS设计并经Meta分析发现IRF6上的rs12405750与NSCPO有关（P=8.8×10-11）。同时研究发现，该位点的不同等位基因对NSCPO和NSCLO亚型作用是相反的。继而在64名NSCPO患者和49名NSCLO患者中探索IRF6的表达情况，发现相对较低的IRF6表达水平是NSCPO的危险因素，是NSCLO的保护因素。在小鼠模型中同样发现IRF6的表达量对腭组织发育影响显著[27]。Ke等[28]通过对小鼠腭组织培养发现IRF6在腭组织融合过程中起到重要作用。以上多个研究表明，IRF6的表达量对NSCPO和NSCLO亚型的作用方向相反，未来仍需在人群中对IRF6开展高质量的验证研究确认其与NSCPO亚型的关系，并开展其表达量及相关调控基因对不同NSOC亚型影响的确证性研究。
2.具备一定研究证据的候选基因:这类基因现有的研究证据包括：GWAS和/或Meta分析研究发现其与NSCPO的发病风险显著关联；表达分析、动物模型等研究支持其生物学功能；但人群中尚缺乏高质量的研究验证其阳性关联。此类候选基因有PAX9和CTNNA2。
(1)配对盒基因9（paired box 9，PAX9）:PAX9位于染色体14q13.3，其作为PAX基因家族的一员，所编码的转录因子在胚胎发育中的作用至关重要，主要参与颅面和肢体的发育，与牙齿的发生、分化密切相关[29]。Huang等[7]多阶段GWAS并经Meta分析后发现PAX9的rs730643（P=2.92×10-16）、rs2415363（P=2.76×10-14）、rs60708031（P=4.39×10-15）达到了全基因组显著性。Maguire等[30]研究发现SLA25A缺失的小鼠可以通过降低PAX9的表达导致NSCPO的发生。Li等[31]在小鼠模型中研究发现PAX9缺陷的胚胎在腭架抬高、重新定向方面存在缺陷，其透明质酸（一种参与腭架抬高的高分子细胞外基质糖胺聚糖）的积累显著减少，并发现Wnt信号通路在PAX9介导的腭二次发育调控中发挥了重要作用。PAX9与NSCPO的关联未来仍需要在人群中开展高质量研究进行验证。
(2)连环蛋白α2基因（catenin alpha 2，CTNNA2）:CTNNA2位于染色体2p12，是与经典钙黏蛋白相关的细胞骨架组分连环蛋白家族的成员。2019年Butali等[12]开展了第一个非洲人群的NSCPO亚型GWAS。研究为两阶段设计，包括205个NSCPO病例和2 159个正常对照。在发现阶段CTNNA2上的rs80004662（P=7.41×10-9）达到了全基因组显著性，经过验证阶段并经Meta分析后发现CTNNA2上的rs80004662（P=7.29×10-9）和rs113691307（P=7.33×10-9）均达到了全基因组显著性。同时该研究发现CTNNA2会在小鼠胚胎第14.5天的口腔结构中表达。另有研究表明CTNNA2在小鸡中的直系同源基因与神经嵴迁移过程有关[32]。2019年Huang等[7]在中国人群中开展的GWAS注意到了该基因，但研究所用的检测芯片没有覆盖到CTNNA2的位点。虽然动物模型发现CTNNA2与细胞骨架成分密切相关，在生长发育过程中起到关键作用，并且在GWAS研究中得到阳性结果，但人群中尚缺乏高质量的大样本研究证实其与NSCPO的关联。
3.现有研究证据较少的候选基因:这类基因现有的研究证据包括①人群中有个别研究报道其与NSCPO存在关联；②表达分析、动物模型等研究支持其生物学功能的研究较少或尚无。此类候选基因有PAX7、SYT14、ARHGAP29、DLK1、POMGNT2、WHSC1、DOCK9、KLHDC4等。
Duan等[33]在已发表的GWAS研究中挑选了38个位点，在中国汉族人群144个NSCPO核心家系中进行验证。研究发现PAX7上的rs742071和SYT14的rs2485893与NSCPO有关。Liu等[34]对一个家系中5名NSCPO患者进行WES研究，发现ARHGAP29是NSCPO的一个重要候选基因。该基因在颌面组织中高度表达，并用多个功能实验证实了这一发现。在小鼠原位杂交和免疫荧光染色研究中发现，ARHGAP29在唇腭组织形成过程中起到重要作用[35]。Huang等[7]所开展的中国人群NSOC GWAS通过多阶段设计并结合生物信息学分析对所发现的基因进行基因本体富集和生物通路富集，最终在NSCPO亚型中共发现了11个达到了全基因组显著水平的基因，其中有10个是没有被发现过的，包括DLK1、POMGNT2、WHSC1、DOCK9、KLHDC4等。目前还没有其他人群研究验证这些基因与NSCPO的关联，未来还需要对这些现有证据较少的候选基因开展进一步的确证性研究。
二、前景与挑战目前发现的与NSCPO相关联的基因位点仅能解释很小的一部分遗传度，还有“消失”的遗传度没有得到合理解释[11]。可能有以下三方面原因：一方面其余未被解释的部分可能是通过表观遗传机制作用的；另一方面NSCPO的发生可能是由诸多具有微小效应的遗传位点共同作用所致，而现有研究仅发现了其中一小部分。还有可能NSCPO是由一些罕见变异位点所致，常见的GWAS等研究无法检测这类变异。探寻这些尚未发现的变异位点需要在更大的样本量中应用新的测序技术；此外，NSCPO可能是由基因和基因交互作用、基因-环境交互作用所致。已有研究发现基因-基因交互作用以及基因-环境交互作用会增加NSCPO的发生风险。
1.表观遗传学:是研究DNA序列不发生改变的情况下，生物表型和基因表达模式发生改变的学科，涵盖内容包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA等。表观遗传学研究发现除了基因组DNA外，一些不影响DNA序列的基因组修饰也会影响个体的发育。虽然通过GWAS、WES、目标区域测序等研究发现了一些和NSCPO发生有关的基因位点，但是这些基因仅能解释总遗传风险中较少一部分，未被解释的一部分可能是通过表观遗传机制作用的。表观遗传学调控机制对细胞分化至关重要，这一过程在每个特定生物体的细胞水平是高度保守的。当这种高度保守的过程直接或间接地受到外部环境影响时，就会导致基因表达的改变，从而导致功能的改变。目前NSCPO相关的表观遗传学研究主要集中在DNA甲基化和微小RNA（microRNAs，miRNAs）与NSCPO发生的关系上。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，而DNA去甲基化则诱导了基因的重新活化。既往机制研究通过动物模型发现不同基因甲基化水平和腭裂发生之间存在关系[36-39]，但在人群中开展的DNA甲基化和NSCPO之间的关系的研究较少。有研究通过生物信息学手段研究DNA甲基化水平与NSCL/P之间的关系[40]，但尚未发现有针对NSCPO亚型的类似研究。Sharp等[41]对150名唇腭裂儿童（其中NSCPO 50例）进行表观基因组关联研究（epigenome-wide association studies，EWAS），发现NSOC各个亚型之间甲基化水平存在差异。NSCPO与NSCLP相比发现有17个基因片段（82个位点）甲基化水平存在差异，NSCPO与NSCLO相比发现有294个基因片段（1 063个位点）甲基化水平存在差异。Joubert等[42]研究表明，新生儿DNA甲基化水平和母亲孕期吸烟存在关联。进一步推测吸烟等NSCPO发生的环境危险因素可能是通过影响DNA甲基化水平导致NSCPO的发生。另外也有在人群中开展的关于miRNAs和NSCPO之间关系的研究。Schoen等[43]将5个NSCPO患者和10个年龄相仿的对照进行比较，研究发现成纤维细胞miRNAs的表达在两组之间存在差异，hsa-miR-93-5p等3个miRNAs在NSCP患者中表达上调，hsa-miR-29c-5p等6个miRNAs在NSCP患者中表达下调。未来可以对NSCPO这一亚型开展大样本量的研究以发现可能的表观遗传学病因。
2.新一代测序技术的应用v由于GWAS理论基础是常见疾病可以归因于人群弱势等位基因频率（minor allele frequency，MAF）大于1%的常见遗传变异，其从理论设计上无法发现频率低但却具有较大致病效应的罕见遗传变异以及新发突变[44]。在传统GWAS中，纳入检测和分析的位点是MAF大于1%~5%的位点，大多数频率低于1%的位点并未被检测或未被纳入分析，然而Kido等[45]研究发现风险等位基因往往富集在弱势等位基因（minor allele）中，尤其是在MAF较低的罕见变异中。随着新一代测序技术的迅速发展、测序费用降低和时间缩短，使得二代测序等技术在大规模人群中的运用成为现实。目前发现的NSCPO候选基因位点大多位于蛋白质非编码区内，所以对人类整个基因组开展WGS将为NSCPO的病因学研究提供了新的可能。与GWAS相比，WGS具有更高的覆盖均匀性，可以更好地识别拷贝数变异、基因融合等罕见变异。此外，WGS还覆盖基因组内含子、启动子、非编码区和调控元件等非编码区域。虽然存在成本高、所需时间长以及产生的数据容量较大等局限性，WGS还没有得到广泛的应用，但WGS在基因组覆盖以及富集策略等方面仍然占有一定优势。出生缺陷领域中，2018年Zhu等[46]在肺动脉高压合并先天性心脏病的病例中进行WGS，研究发现参与Wnt和Notch信号通路的SOX17上存在罕见变异并能够解释约3.2%的病例。目前在NSOC中，已有对NSCLP的WGS[47]，尚未发现针对NSCPO亚型的WGS发表。未来针对NSCPO亚型开展的WGS为探索其未被解释的遗传度提供了新的机遇。
3.基因-基因交互作用、基因-环境交互作用:基因与发育过程中环境危险因素暴露之间可能存在相互作用，进而导致了NSCPO的发生。一项包含5项病例对照研究的Meta分析研究发现TGFA与吸烟在导致NSCPO发生可能存在基因环境交互作用[48]。既往有研究发现叶酸补充在人群中对唇腭裂有预防作用[49-50]。Beaty等[9]2011年在GWAS中考虑了包括叶酸在内的多种维生素补充，同时也纳入母亲孕期被动吸烟、饮酒共三项环境因素，探讨基因-环境交互作用。研究发现在NSCPO亚型的患者中BAALC和维生素补充之间存在交互作用，TBK1、ZNF236与母亲孕期被动吸烟之间存在交互作用，MLLT3和SMC2基因与母亲饮酒存在交互作用。Wu等[51]在亚洲和欧中人群中做了相似的研究，发现SLC2A9基因上的rs3733585、rs12508991以及WDR1基因上的rs6820756、rs7699512这4个位点与母亲孕期被动吸烟这一环境因素可能存在基因-环境交互作用。Nikopensius等[25]对GWAS及其他研究中发现的40个NSOC候选基因验证研究中，发现NSCPO患者中MSX1和BMP2，FGF1和PVRL2，COL2A1和FGF2之间存在基因-基因交互作用。Duan等[33]在已发表的GWAS研究中挑选了38个位点，在中国汉族人群144个NSCPO家系中进行验证，研究发现DIEXF和SYT14之间存在基因-基因交互作用。然而上述研究还处在探索阶段，仍缺乏其他独立人群研究、生物学机制研究的验证。未来仍需要在人群中开展相关研究验证其结果。
三、总结与展望NSCPO为多基因遗传病，遗传和环境因素均会影响其发生风险。与NSCL/P不同，GWAS发现的与NSCPO相关联的位点非常有限，提示NSCPO可能是由多个微效基因位点作用所致，目前的研究结果只能解释NSCPO很小一部分遗传度。后GWAS时代，WES、WGS等新型测序技术开始应用于NSCPO病因学研究中，这将为揭示NSCPO发生的遗传危险因素及其作用机制提供重要证据。复杂疾病的病因学研究不仅需要从统计学意义上发现疾病相关基因，更要揭示基因突变如何参与疾病发生的生物学机制。即便是人群关联证据比较明确的候选基因，今后仍需要继续定位致病位点、阐明其生物学致病机制。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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