人肠道病毒（enterovirus，EV）感染导致多种疾病，如手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）、疱疹性咽峡炎、急性弛缓性麻痹、无菌性脑膜炎、急性心肌性炎等^[1-6]，临床症状包括轻型发热及严重并发症等。其中HFMD是由多种EV引起的一种儿童常见传染病，常引起5岁以下婴幼儿发病，属于国家丙类法定报告传染病。临床特征引起病例发热，手、足、口腔和臀部等部位出现皮疹，还可以引起个别患儿脑炎、心肌炎、肺水肿、弛缓性麻痹等症状，甚至导致死亡^[7]。根据其亲缘关系可将感染人的EV分为A、B、C、D共4组，柯萨奇病毒A组8型（Coxsackievirus A8，CV-A8）属于A组^[8]。近年来EV-A和HFMD之间的关系是EV研究热点之一。本研究旨在对中国2013-2018年分离自HFMD病例中CV-A8进行全基因组序列和分子进化特征分析，阐明目前存在的CV-A8优势基因型，探讨CV-A8全基因组及各个编码区遗传信息在病毒溯源方面的关系。

1. 毒株：来自我国2013-2018年HFMD监测系统病例分离株。毒株在-80 ℃冰箱中冻存，实验前为提高病毒滴度，使用人横纹肌肉瘤（RD）细胞和人喉癌上皮（HEp-2）细胞进行病毒扩增，待出现特异致细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）后收获，于-80 ℃冰箱保存待用^[9]。

2. 核酸提取：试剂采用杭州博日公司生产的商品化试剂盒（Simple P Total RNA Extraction Kit，BilFlux），对病毒分离物进行核酸提取，提取步骤及试剂配制均严格按照说明书要求进行操作。

3. 全基因组扩增：从GenBank下载CV-A8全基因组序列，采用Primer 5.0软件设计引物，序列见表 1。PCR扩增试剂采用日本TaKaRa公司的DRRO057A One-step RT-PCR Kit，反应条件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 70 s，32个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。扩增的特异核酸片段采用2%琼脂糖凝胶电泳分析，每次实验均设阴性对照。

表 1 CV-A8全基因组引物序列

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4. 全基因组序列测定与分析：应用ABI3130型全自动序列分析仪完成序列测定，采用Squencher 5.0软件对序列进行拼接比对，采用MEGA 7.0软件对核苷酸及氨基酸多序列进行同源性比对^[10]，采用邻接法构建亲缘进化树^[11]，通过1 000 bootstrap评估建树可靠性。本研究获得的11株CV-A8毒株的全基因序列已上传GenBank，编号为MT648778~ MT648788。见表 1。

1. 病毒基因组测定：共获得11株CV-A8毒株的全基因序列，GenBank编号为MT648778~ MT648788。11株CV-A8毒株相关实验室信息及基因型信息见表 2。

表 2 11株CV-A8相关信息汇总

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11株CV-A8毒株中，6株基因组长度为7 394 bp，5'-UTR为743 bp；2株（97/JX，115/JX）的基因组长度为7 393 bp，5'-UTR为742 bp；1株（HZ040/SD）基因组长度为7 400 bp，5'-UTR为749 bp；1株（13-467/GS）基因组长度为7 399 bp，5'-UTR为748 bp；1株（13-38/TJ）基因组长度为7 397 bp，5'-UTR为746 bp。与CV-A8原型株比较，6株没有缺失与插入，2株（97/JX，115/JX）在574位点有1个碱基缺失；1株（HZ040/SD）在105~108位点、129~130位点有6个碱基插入；1株（13-467/GS）在106~108位点、129~130位点有5个碱基插入；1株（18-38/TJ）在108位点、129~130位点有3个碱基插入。11株CV-A8基因组编码区长度均为6 657 bp，共编码含2 189个氨基酸多聚蛋白，3'-UTR长度为80 bp序列。与CV-A8原型株（Donovan株）比较，11株CV-A8在编码区没有碱基缺失与插入，但在3'-UTR的7 333~7 334位点11株均存在2个碱基缺失。见表 3。

表 3 11株CV-A8毒株全基因组各区域核苷酸及氨基酸数目

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2. 遗传进化分析：同源性进化分析结果显示，11株CV-A8毒株全基因组序列核苷酸和氨基酸同源性分别为81.3%~98.8%和95.9%~99.5%；各区段比对发现，5'-UTR、P1、P2、P3各区域核苷酸同源性分别为82.8%~99.2%、79.4%~99.0%、81.2%~98.8%、82.7%~98.7%；编码区P1、P2、P3各区域氨基酸同源性分别为95.1%~99.6%、97.0%~99.8%、95.2%~99.5%；VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为78.3%~98.6%和92.6%~99.7%；与CV-A8原型株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为78.3%~98.2%和92.6%~99.7%。

为了解本研究11株CV-A8遗传进化情况，从GenBank下载所有国内外22条CV-A8全长VP1区核苷酸序列，与CV-A8原型株构建VP1区系统进化树，见图 1；同时从GenBank下载所有国内外包含CV-A8原型株在内的12条CV-A8全基因序列，与EV-A的原型株构建全基因组及P1、P2、P3区系统进化树，见图 2、3。VP1区进化树显示，所有CV-A8划分为5个基因型：CV-A8原型株（Donovan株）为基因型A的唯一成员，于1949年分离于美国；基因型B由印度、俄罗斯和美国的6株CV-A8组成，分离年代为2004-2008年；基因型C由1株2007年分离于土库曼斯坦CV-A8和本研究1株2018年分离于中国的CV-A8组成；基因型D由14株中国CV-A8组成，分离时间为2011-2015年，包括本研究的2株CV-A8；基因型E由最新分离的中国CV-A8和澳大利亚CV-A8组成，分离时间为2014-2018年，包括本研究8株CV-A8和2株澳大利亚CV-A8，以上内容提示E基因型为目前中国及全球CV-A8优势基因型。

注：▲本研究分离株 图 1 11株CV-A8和GenBank 23株CV-A8 VP1区基因系统进化树

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注：▲本研究分离株 图 2 11株CV-A8和GenBank 12株CV-A8全基因组系统进化树

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注：▲本研究分离株 图 3 23株CV-A8和EV-A原型株（11株来自本研究和12株来自GenBank）和EV-A原型株P1、P2、P3区系统进化树

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全基因组系统进化树显示，本研究11株CV-A8与GenBank所有12株CV-A8在进化树中和VP1区基因型别一致，C、D、E 3个基因型分别处于3个分支共同进化。各编码区均构建亲缘进化树，遗传进化分析显示，P1衣壳编码区亲缘进化树显示所有CV-A8与其原型株同源性最高，独立成簇，单源进化；P2非衣壳编码区亲缘进化树显示所有CV-A8均和CV-A5进化距离最近，其中本研究的8株E基因型CV-A8和CV-A4、CV-A14和CV-A16原型株进化距离最近，提示存在基因重组现象；P3非衣壳编码区亲缘进化树显示所有E基因型CV-A8和CV-A5、CV-A16、CV-A14和CV-A4进化距离较近，也提示存在和其他EV-A发生重组，另本研究1株C基因型和2株D基因型CV-A8和其他CV-A8独立成簇并2个分支共同进化。

病毒性传染病的预防和控制、尤其是病毒性传染病突发公共卫生事件的应对，需要快速对致病病原体进行鉴定和溯源。目前多数传染病的溯源技术仍是基于经验性评估或基于描述性流行病学数据推测，病原体本身的基因组学特征在预测模型中难以体现。随着基因组学技术和生物信息学以及大数据管理技术的迅速发展，新一代基因组DNA测序技术可以对标本中致病微生物实现更加详细的分析，通过生物信息学分析和大型服务器的高速运算对全基因组序列数据进行加工整理，可以准确进行病毒溯源，洞悉病原体的进化过程。

本研究依托国家重大专项课题《艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治》之子课题基于宏基因组学的病毒网络化监测和溯源技术体系研究分析，对我国2013-2018年中国HFMD网络分离的11株CV-A8分离株全基因组及各个编码区遗传进化分析。VP1区进化树显示，所有CV-A8划分为5个基因型（A~E），其中E基因型为目前中国CV-A8优势基因型。但在2008-2012年，全国HFMD实验室网络没有发现CV-A8，可能是因为它们的传播率较低；从2013年开始，鉴定出11个CV-A8样本，这可能是因为在这段时间内，CV-A8的遗传率开始增加。全基因组系统进化树显示，本研究中的8株E基因型CV-A8与CV-A4、CV-A14和CV-A16原型株进化距离最近，提示存在基因重组现象。重组是EV中经常观察到的现象，更重要的是，通过消除有害突变，重组一直被认为是EV进化的驱动力，这可能产生新的具有更高毒力和传播能力的重组体，如疫苗衍生脊髓灰质炎病毒。E基因型的CV-A8株可能通过重组获得一些有利的非衣壳区特性，并以某种方式赋予更高的遗传率。尽管CV-A8在HFMD病原体中检出较少，且目前病例临床表现以轻症为主，但在CV-A8的衣壳区基因多样性和非衣壳区重组多样性表明，CV-A8准种仍在经历变异动态变化。它们可能是EV-A基因库中重要的重组交换体，有助于自身或其他EV获得优势特性。以上内容提示CV-A8全基因组及各个编码区在病毒溯源方面提供更多数据支撑。

目前我国尚未建立专门的EV监测系统，EV监测主要依赖于我国AFP和HFMD两大网络监测系统。虽然EV-A71、CV-A16和CV-A6已被普遍认为是世界范围内HFMD的主要病原体，但近年来，包括CV-A8在内的其他EV也被频繁报道。本研究EV-A组11株CV-A8均来自HFMD监测网络；已有报道CV-A8也是导致疱疹性咽峡炎的常见病因^[1]，但中国疾病监测报告系统中并未纳入疱疹性咽峡炎；此外，多种临床表型，包括AFP、板层鱼鳞病、呼吸系统疾病等，都与CV-A8感染有关，因此，CV-A8相关疾病的负担可能被低估了。本研究发现CV-A8具有衣壳多样性（多基因型）和频繁的重组（不同的基因型内重组谱系），说明CV-A8准种仍在不断发生变异和重组。从表面上看，CV-A8正在选择一种能适应宿主环境的毒株。CV-A8有可能成为HFMD的重要病原体，所以，需要加强CV-A8监测力度，以补充不同时间、不同地区CV-A8分离株基因特征信息，进一步全面动态解析CV-A8流行及遗传进化趋势；同时，鉴于EV之间基因重组现象越来越普遍^[12]，必然引发病毒毒力或传播力的改变，为病毒溯源提供更多精准信息，我国应尽快建立专门的EV监测系统，为EV引起相关疾病的防控工作提供全面精准的实验室数据支撑。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突