2021, Vol. 42
文章信息
- 王成玲, 王嘉正, 刘志国, 徐帅, 朱雄, 李欢, 王晓霞, 邱小彤, 魏孔娇, 范仕弘, 韩李超, 李振军.
- Wang Chengling, Wang Jiazheng, Liu Zhiguo, Xu Shuai, Zhu Xiong, Li Huan, Wang Xiaoxia, Qiu Xiaotong, Wei Kongjiao, Fan Shihong, Han Lichao, Li Zhenjun
- 纹带棒状杆菌多位点序列分型及应用
- Establishment and application of a multilocus sequence typing assay for Corynebacterium striatum
- 中华流行病学杂志, 2021, 42(9): 1628-1634
- Chinese Journal of Epidemiology, 2021, 42(9): 1628-1634
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.cn112338-20210329-00255
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文章历史
收稿日期: 2021-03-29
2. 山东第一医科大学第一附属医院(山东省千佛山医院)检验医学科, 山东省医药卫生临床检验诊断学重点实验室, 济南 250000;
3. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 传染病预防控制国家重点实验室, 北京 102206;
4. 海南省三亚市人民医院检验科, 中心实验室 572000
2. Department of Clinical Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital(Shandong Qianfoshan Hospital) of Shandong First Medical University, Shandong Medicine and Health Key Laboratory of Laboratory Medicine, Ji'nan 250000, China;
3. State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China;
4. Central and Clinical Laboratory of Sanya People's Hospital of Hainan Province, Sanya 572000, China
纹带棒状杆菌(Corynebacterium striatum)是临床微生物实验室中常见的条件致病菌[1-2]。通常情况下纹带棒状杆菌是人体正常微生物群系的重要组成部分，可定植于人的皮肤和黏膜，而不产生致病性[3-4]。近年来，随着临床微生物组学及宏基因组学研究的兴起，越来越多的研究表明纹带棒状杆菌是引发慢性阻塞性肺疾病患者院内呼吸道暴发感染的重要病原体[5-7]。此外，由于现代化检查及治疗手段在临床中的应用和免疫抑制剂的频繁使用，导致纹带棒状杆菌引发院内感染事件频发，常见的报道有肺炎[6]、败血症[8]、骨髓炎[9]等。基于分子手段开展纹带棒状杆菌的院内暴发感染分析，对完善纹带棒状杆菌院内感染监测和深入了解其院内传播途径有重要的临床流行病学意义。
多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是从多位点酶电泳(multilocus enzyme electrophoresis，MLEE)方法衍生出来的一种新的分子分型方法。在1988年由Maiden等[10]运用于对自然变异的脑膜炎奈瑟菌的分型。随后，被广泛应用于细菌的微进化、群体生物学和流行病学等方面的研究[11-12]。该方法具有操作简单、重复性好及分辨率高等特点，不仅能对不同实验室的结果数据进行共享比对，还可进行病原菌的种群结构及进化方面的研究[13]。当前，我国纹带棒状杆菌MLST分析方法尚未建立，本研究以2016-2020年自北京市、河北省、广东省、山东省4家医院分离的342株纹带棒状杆菌和2株参考菌株为研究对象，探讨以7个管家基因为靶点建立纹带棒状杆菌的MLST分型方法，并对不同来源纹带棒状杆菌分离株进行分析评价，解析其种群结构及进化关系，为纹带棒状杆菌的监测、防控提供科学参考依据。
材料与方法1. 菌株来源：本研究所使用的纹带棒状杆菌共344株，包括342株临床分离株和2株参考菌株。342株临床纹带棒状杆菌来源于2016-2020年北京市、河北省、广东省、山东省4家医院检验科或临检中心。参考菌株为纹带棒状杆菌ATCC 6940T和ATCC 43751均购自美国模式菌种收集中心。342株临床分离纹带棒状杆菌均保藏于中国CDC传染病预防控制所。所有菌株在本研究开展前均采用16S rRNA基因测序方法进行复核。
2. 主要试剂与仪器：哥伦比亚血平板(英国OXOID公司)、细菌基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]、2×TaqMasterMix(康为世纪生物科技有限公司)、5×TBE(中国北京睿博兴科生物技术有限公司)，所有试剂均按说明书指定条件保藏并在有效期内使用。B2生物安全柜(中国北京东联公司)、基因扩增热循环仪(中国西安天隆科技有限公司)、电泳仪(美国伯乐公司)、凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。
3. 基因组DNA的制备：在生物安全二级实验室中按照标准的细菌操作规范对菌株进行复苏，随后挑取每个菌株的单菌落接种在哥伦比亚血琼脂平板于37 ℃孵育18~24 h后，使用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取试剂盒并严格按照说明书指定步骤提取菌株的DNA，制备好的DNA用紫外线可见分光光度计ND-2000进行检测后-20 ℃保存备用。
4. 管家基因的选择及引物设计：对342株临床分离株及参考菌株ATCC 43751的管家基因进行扩增和测序，模式菌株ATCC 6940T基因序列自GenBank数据库下载。根据文献中提供的引物合成16S rRNA[14]、gyrA[15]、rpoB[16]及hsp65[17]基因的引物，并根据sodA、gyrB及secA1 3个基因的保守区域应用Primer 5.0软件设计上、下游引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列和扩增长度见表 1。
5. MLST-PCR扩增：PCR扩增采用25 μl反应体系，PCR反应条件：16S rRNA、gyrA、rpoB及hsp65基因根据上述文献[14-17]提供的扩增条件进行扩增；sodA、gyrB及secA1基因退火温度分别为55、55、60 ℃。扩增片段经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将阳性扩增产物送交北京睿博兴科生物技术有限公司纯化并进行双向测序。
6. 序列分析：采用BioEdit软件分析测序峰图并纠正位点误读，采用SeqMan (DNASTAR. Lasergene.7.1)软件对序列进行拼接整理，弃除序列两端测序丰度较低的序列。采用MEGA 7.0.14软件载入拼接序列，采用ClustalW将实验菌株的序列与标准等位基因型序列进行比对分析，确定每个位点的等位基因型，将7个位点的等位基因组合从而确定菌株的ST。测序得到的rpoB、gyrA及16S rRNA基因序列与已上传至EMBL数据库中的序列(登录号：HE586270~HE586300)进行比对和计算，相似性达到100%时赋予相同的等位基因号，否则按照数据库的相关规则分配新的等位基因号。hsp65、sodA、gyrB及secA1基因的等位基因编号经比对分析后获得。
7. 管家基因的遗传多态性评价：采用DnaSP 5.10.01软件分析计算管家基因遗传多样性，并计算相关系数。采用DnaSP 5.10.01软件中的Tajima's D、Fu and Li's D和Fu and Li's F等统计学方法进行管家基因中性进化检验。通过Splits tree 4.14.2软件构建7个管家基因序列及相应ST的进化树以分析纹带棒状杆菌遗传特征。
8. ST序列的系统进化分析：采用MEGA 7.0.14软件，获得所有菌株的等位基因谱。之后将7个等位基因按sodA-rpoB-gyrA-gyrB-hsp65-secA1- 16S rRNA顺序串联，确定菌株的序列型别(sequence types，STs)。采用MEGA 7.0.14软件构建系统发育树，采用BioNumerics软件对纹带棒状杆菌菌株不同ST构建最小生成树(Minimum Spanning Tree)，并用eBURST软件计算各菌株ST的克隆复合体(clone complex，CC)，分析菌株间的亲缘进化关系。
结果1. 管家基因多样性分析：各管家基因的等位基因数量范围为12~18个，sodA位点的等位基因数量最多，为18个，其余依次为hsp65 17个，gyrA、gyrB分别为14个，rpoB、16S rRNA分别为13个，secA1相对变化较小，等位基因为12个。管家基因的多态性位点数共有140个，以hsp65的数量最多，为26个，其次为gyrB基因，包含有25个多态性位点，最少的为16S rRNA，含有13个多态性位点。核苷酸多态性(pi)值在0.001 9(16S rRNA)~0.011 8 (gyrB)之间。见表 2。
2. 基因中性试验分析：7个管家基因的Tajima's D值介于-1.587 27~1.511 19之间，差异均无统计学意义(P > 0.05)；在Fu and Li's D检验中，只有sodA基因的差异有统计学意义(P < 0.05)，其余6个管家基因的差异均无统计学意义(P > 0.05)；在Fu and Li's F检验中，只有16S rRNA基因的差异有统计学意义(P < 0.05)，其余6个管家基因的差异均无统计学意义(P > 0.05)。见表 3。
3. 等位基因序列重组分析：分析表明序列呈复杂的网状结构，提示纹带棒状杆菌分离株在其进化过程中存在重组事件。见图 1。
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| 图 1 纹带棒状杆菌管家基因的重组分析图 |
4. ST分布特征：7个管家基因将344株纹带棒状杆菌分为72个STs，其中菌株数量最多的ST为ST16(95株)，占27.6%；其次含有菌株数较多的是ST8(49株)，占14.2%；ST50含22株菌，占6.4%；ST24和ST44分别含17株菌，各占4.9%。有41个ST只含1株菌，占11.9%。不同分离地的菌株序列型较丰富，不同分离地的菌株存在相同的序列型，同一分离地的菌株存在不同的序列型。不同分离时间的菌株分型结果也存在显著差异，不同分离时间的序列型之间存在交叉，同一分离时间的菌株也有着不同的序列型。
5. ST的eBURST分析：344株纹带棒状杆菌的72个STs经eBURST 3.0软件分析，共形成了10个CCs及18个独特性(Singleton)。10个CCs中CC19是含分离株数(141株)最多的克隆复合体，是优势克隆复合体，且在CC19中，ST19占据核心地位，被认为是祖先序列型。ST19共包含分离自2019年山东省的4株菌。344株纹带棒状杆菌中形成克隆复合体的分离株共有295株，占所有菌株的85.7%。见图 2。10个CCs所包含的ST、菌株数及其分离地、分离时间见表 4。
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| 图 2 344株纹带棒状杆菌分离株的eBURST分析 |
6. ST序列系统发育分析：采用MEGA 7.0.14最大似然法(Maximum-Likelihood，M-L)构建系统发育树揭示纹带棒状杆菌的进化关系。系统发育树的分析结果与eBURST分析结果基本一致，处于同一克隆复合体的ST属于相同分支，亲缘关系较近。见图 3。
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| 图 3 344株纹带棒状杆菌分离株的最大似然法进化树 |
7. MLST最小生成树分析结果：本研究分别以分离地区、分离时间为基准，研究344株纹带棒状杆菌之间的亲缘关系，构建最小生成树图。最小生成树的结果与eBURST软件的分析结果基本吻合，同一克隆系内的分离株之间均用黑实线相连，亲缘关系最近；不同克隆谱系之间用灰实线或虚线连接，亲缘关系稍远；342株临床分离株与2株参考菌株之间均用虚线连接。见图 4。
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| 注：每个圆圈代表一种ST，圆圈大小代表菌株数量，圆圈之间的连线的长短及虚实度表示分离株间亲缘关系的远近 图 4 344株纹带棒状杆菌最小生成树 |
由图 4A可以看出，342株临床分离株存在一定的地域聚集性，山东省的分离株与其余三地的菌株之间均有黑实线连接，与北京市、河北省的分离株之间灰实线连接也较多；且北京市、河北省及广东省的大部分分离株具有相同的ST(ST16)；同一地区分离株之间也存在虚线连接如山东省的分离株ST31和ST52、ST42和ST69。
由图 4B可以看出，不同分离时间的分离株的ST分布较松散。分离自2016年的菌株与分离自2017、2018年的菌株之间既有相同的ST(ST8、ST16、ST24、ST44、ST50)也有虚线的连接，分离自2017、2018、2019及2020年的菌株之间也有相同的ST(ST59)；大部分分离自同一年份的分离株之间用黑实线连接，且相邻年份的分离株之间亲缘关系也较近。
讨论等位基因的数量反映管家基因的多样性，等位基因数量越多，其多样性越丰富。各管家基因的等位基因数量分布在12~18之间，sodA位点的等位基因数量最多，表明本研究菌株的多态性主要来自该位点，secA1位点的等位基因数量最少，表明中国菌株的secA1位点较为保守，但有待更多菌株的分析加以证实。来自国外的研究[18-20]表明，rpoB位点多态性较高，与本研究结果不同，表明菌株的多态性存在差异。基因重组在细菌进化中起推动作用，本研究显示342株临床分离株间存在一定的重组事件，与Gomila等[18]的研究一致，提示基因重组是纹带棒状杆菌遗传多样性的一个重要原因。管家基因的中性试验分析表明，纹带棒状杆菌通过等位基因产生同义替换而导致的同源重组确实存在，但大多数在遗传进化过程中被淘汰，细菌发生基因重组可能是为了更好地适应环境。
ST与宿主的地域来源具有一定的相关性。来自中国4个省(市)(北京市、广东省、河北省和山东省)的分离株，在优势克隆复合体CC19中均有分布，提示上述4个省(市)分离的纹带棒状杆菌具有潜在的遗传相似性。此外，ST19包含4株分离自2019年山东省的菌株在该克隆系中占据核心地位，被认为是本研究菌株的祖先序列型，来自不同宿主的更多菌株的类似研究是必要的。值得一提的是在CC19中，包含菌株数最多的ST是ST16，分离自北京市、河北省和广东省且与山东省的大部分分离株亲缘关系较近，暗示该ST的菌株可能会发展成为优势菌群，应加强对这种ST菌株致病力的监测；来自河北省的大部分菌株与北京市的大部分菌株处于同一克隆谱系的同一分支，提示此两地区菌株型别相似，可能由于地理距离较近而导致菌株间的亲缘关系较近；来自广东省的大部分菌株与北京市的部分菌株也处于同一克隆谱系的同一分支，提示可能由于两地的人员流动较大而导致菌株遗传多样性的增加，但鉴于标本量少，仍需要大样本监测；来自山东省的部分纹带棒状杆菌自成4个克隆系：CC11、CC42、CC52、CC59，提示山东省的纹带棒状杆菌ST相对靠拢且相对其他省份独立，可能存在潜在的优势克隆群，该地区菌株具有较高的遗传多样性。
不同分离时间的序列型之间存在交叉，同一分离年份的菌株也有着不同的ST，可以推测同一年份收集的菌株ST分布相对松散；不同分离年份之间的菌株也有着相同的ST，且相邻分离年份的菌株之间亲缘关系较近，提示ST与分离时间有一定的相关关系。2016年分离株(全部来源于北京市)主要是ST16，2017-2018年分离株(来源于北京市、河北省、广东省及山东省)也主要是ST16，2019- 2020年分离株(全部来源于山东省)主要ST分别是ST66和ST62，推测ST16所包含的纹带棒状杆菌分离株的进化时间较长。
目前国内外尚无标准的纹带棒状杆菌MLST分型方案，本研究建立了纹带棒状杆菌7个管家基因的多位点序列分型技术。但由于本研究所涉及的各个地区菌株有限，所以研究该时间点的地区分布状况受到限制，为达到预期应用效果，仍需要更多数量及来源的纹带棒状杆菌进行进一步验证。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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