妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指在妊娠期首次发现的糖耐量受损，是孕妇常见的并发症之一^[1]。GDM影响全球9.8%~25.5%的孕妇，我国GDM发病率约为14.8%~17.6%^[2-3]。随着人们生活水平的提高和饮食结构的变化，我国GDM的发病率显著增加^[4]。GDM会对孕妇及其后代的健康产生巨大影响。一方面，GDM女性的围产期发病风险显著增加，未来更容易患上2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）和心血管疾病^[5-6]。此外，其子代出现巨大儿、新生儿低血糖、高胆红素血症和新生儿呼吸窘迫综合征的风险较高，还会增加儿童时期的肥胖和成年后的心血管疾病风险^[7-9]。因此，GDM已成为世界范围内一个重要的公共卫生问题。目前GDM的具体机制尚不清楚，β细胞功能障碍和胰岛素抵抗被认为是GDM发病的关键，其中β细胞的主要功能是储存和分泌胰岛素^[10]。研究表明GDM是由遗传和环境因素共同作用导致的疾病^[11]，遗传因素已被发现在调控胰岛素分泌和外周胰岛素敏感性中发挥着重要作用^[12-13]。维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）是类固醇激素受体超家族的成员，维生素D在与VDR结合后显示出生物学活性^[14]，已有多项研究发现维生素D缺乏可能会增加GDM的发病风险^[15-16]。VDR基因参与胰岛素代谢途径，其多态性与胰岛素抵抗和胰岛素分泌能力有关^[17-19]。研究显示VDR基因与T2DM的发生有关^[20-21]，而GDM和T2DM有相似的病理机制和遗传易感性^[22]，提示VDR基因可能在GDM的发病中具有类似的作用。国内外有关VDR基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点与GDM的关联性研究较少，相关研究结论不一致^[23]。因此，本研究以山西医科大学第一医院产科住院分娩的孕妇为研究对象，通过病例对照研究来探讨VDR基因16个SNP位点与GDM之间的关系，为GDM的致病机制研究提供线索。

对象与方法

1. 研究对象：以2012年3月1日至2014年7月30日在山西医科大学第一医院产科住院分娩的孕妇为研究对象。纳入标准：①孕周≥20周；②汉族；③无精神疾病；④年龄≥18岁。排除标准：问卷信息不全及未提供血样者。采用标准化结构式调查问卷，由培训合格的调查员在孕妇分娩后进行面对面问卷调查，并查阅获取相关病历信息。问卷内容包括一般人口学特征、生活方式、疾病史、家族史等。本研究通过山西医科大学伦理委员会审查（批准文号：2014092），研究对象均签署知情同意书。

GDM诊断采用国际糖尿病与妊娠研究组的诊断标准^[24]。在研究对象妊娠24~28周进行75 g口服葡萄糖耐量试验，分别测量空腹及口服葡萄糖后1、2 h血糖。排除妊娠前已患有糖尿病，且满足下列标准中任意一项即可诊断为GDM：①FPG≥5.1 mmol/L；②1 h血糖≥10.0 mmol/L；③2 h血糖≥8.5 mmol/L。研究对象中被诊断为GDM的孕妇有334例，根据年龄（±2岁）、妊娠时间（相差不超过3个月）及居住地信息1∶1匹配相应的健康对照孕妇。对研究对象进行DNA基因分型，剔除基因分型缺失率 > 10%者，其中11例病例和14例对照孕妇因为基因分型缺失率过高而被剔除，最终323例病例和320例对照纳入本研究。

2. 基因分型：研究对象自愿提供血样，储存-80 ℃冰箱中。使用OMEGA Blood DNA Mini Kit（美国Omega Bio-tek公司）试剂盒对DNA进行提取、分离和纯化。使用Illumina Goldengate Platform（美国Illumina公司）对SNP位点进行分型。每个96孔板上挑选5%的样品做重复样检测，以作为质控。所有SNP完成检测率≥99%。SNP筛选标准：①最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF） > 0.05；②Hardy-Weinberg平衡检验P > 0.05。

3. 统计学分析：使用EpiData 3.1软件建立数据库并使用SAS 9.4和R 3.6.3软件进行统计学分析。近似服从正态分布的定量资料采用x±s表示，定性资料用百分比（%）表示，单因素分析使用χ²检验。用“minPtest”R包在基因水平上检查VDR基因与GDM的关联性。使用非条件logistic回归调整孕前BMI和糖尿病家族史后，在共显性、显性、隐性和等位基因遗传模型中，分析基因型和GDM之间的关系。其中共显性遗传模型是以野生纯合型为参比组，探讨杂合型和突变纯合型对GDM的影响；显性遗传模型是以野生纯合型为参比组，探讨（杂合型+突变纯合型）对GDM的影响；隐性遗传模型是以（野生纯合型+杂合型）为参比组，探讨突变纯合型对GDM的影响；等位基因遗传模型是以野生等位基因为参比组，探讨突变等位基因对GDM的影响。多重比较采用错误发现率方法，α=0.2^[25]。使用Haploview软件评估单倍型结构，相互之间高度连锁的SNP位点构成了单倍型区块，其中连锁不平衡图颜色从白色到红色，代表连锁程度从低到高，并在“haplo.stats”R程序包中分析VDR基因单倍型与GDM之间的关系。以P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

1. 一般情况及单因素分析：纳入643名研究对象，GDM组323人，对照组320人。孕妇年龄为（30.3±4.3）岁，52.1%的孕妇文化程度为大学及以上，人均月收入集中于2 000~3 999元（58.0%）。GDM组和对照组孕前BMI和糖尿病家族史差异有统计学意义（P < 0.05），而文化程度、人均月收入、孕期增重、产次、胎儿性别、高血压家族史在GDM组与对照组之间分布均衡，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。

2. Hardy-Weinberg遗传平衡检验：经过质控后共得到VDR基因的16个SNP位点，Hardy-Weinberg平衡检验显示，所有位点均符合Hardy-Weinberg平衡（P > 0.05），被纳入基因关联性分析。见表 2。

3. VDR基因SNP位点与GDM发病风险的关系：在基因水平上，VDR基因与GDM发生风险有关（P < 0.05）。在调整孕前BMI、糖尿病家族史后，非条件logistic回归结果显示，在共显性、显性、隐性和等位基因遗传模型下VDR基因有4个SNP位点与GDM的发生风险有关。其中，在共显性遗传模型下，rs7967152位点（AC vs. AA，OR=1.58，95%CI：1.13~2.21）、rs2238140位点（AA vs. GG，OR=2.24，95%CI：1.19~4.20）、rs2853564位点（AG vs. AA，OR=1.46，95%CI：1.04~2.05）、rs2853566位点（AG vs. AA，OR=1.43，95%CI：1.03~2.00）与GDM风险升高有关。见表 3。在显性遗传模型下，rs7967152位点（AC+CC vs. AA，OR=1.58，95%CI：1.15~2.18）、rs2238140位点（GA+AA vs. GG，OR=1.48，95%CI：1.07~2.03）、rs2853564位点（AG+GG vs. AA，OR=1.45，95%CI：1.05~2.00）、rs2853566位点（AG+GG vs. AA，OR=1.41，95%CI：1.02~1.94）与GDM风险升高有关。见表 4。在隐性遗传模型下，尚未发现VDR基因的4个SNP位点与GDM的发生风险有关。见表 5。在等位基因遗传模型下，rs7967152位点（C vs. A，OR=1.41，95%CI：1.10~1.82）、rs2238140位点（A vs. G，OR=1.43，95%CI：1.11~1.83）与GDM风险升高有关。见表 6。

4. VDR基因单倍型与GDM发病风险的关系：经Haploview软件分析，16个SNP位点中存在5个单倍型区块，分别为区块1（rs1544410、rs7967152）、区块2（rs1540339、rs2239179、rs12717991、rs886441）、区块3（rs2238138、rs2239186）、区块4（rs2238136、rs2853564、rs11168284）、区块5（rs4237855、rs7136534、rs11574012）。见图 1。在调整孕前BMI和糖尿病家族史后，经非条件logistic回归分析，区块1（rs1544410、rs7967152）的GC单倍型是GDM的危险因素（OR=1.50，95%CI：1.15~1.97）。见表 7。

讨论

GDM是一种常见的妊娠并发症，对孕产妇和子代造成短期和长期的不良后果，除了生活方式干预外，目前没有广泛接受的预防策略^[10]。本研究通过病例对照研究来探讨VDR基因SNP位点与GDM之间的关系，为GDM的致病机制研究提供线索。

本研究分析了中国中部地区人群中VDR基因SNP位点与GDM发病风险之间的关系，结果发现VDR基因rs7967152、rs2238140、rs2853564、rs2853566位点多态性及区块（rs1544410、rs7967152）GC单倍型与GDM的发病风险升高相关。VDR基因位于染色体12q13.1上，是维生素D发挥作用的效应基因。VDR广泛分布在体内各种组织和细胞中，维生素D通过与VDR结合来发挥其生物活性作用，VDR对靶组织中的维生素D活性至关重要。维生素D能够调节体内钙磷代谢过程，同时也能够调节免疫，影响机体的免疫功能^[26]，维生素D缺乏与GDM有关^[15-16]。维生素D可以通过直接激活胰岛β细胞中的VDR，进而影响胰岛β细胞的功能，促进胰岛素分泌；通过调节细胞内钙离子浓度，影响胰岛素的合成与分泌；通过调节免疫功能，抑制全身炎症反应，从而减少对胰岛β细胞的免疫损伤，维持其功能^[27-28]。维生素D能够影响GDM发病的关键环节，因此影响维生素D作用的基因发生变异可能会影响GDM的发生。而VDR基因的多态性可能会影响VDR的表达，从而影响维生素D的功能发挥，进而可能会影响GDM的发生。且已有研究表明VDR基因多态性与胰岛素抵抗有关，可能反映胰岛素敏感性的变化^[18]，并且与胰岛素分泌能力有关^[19]。而β细胞功能障碍和胰岛素抵抗增加是GDM发生的关键^[10]，因此VDR基因变异孕妇可能易患GDM。

目前国内外对VDR基因多态性与GDM的关联性研究较少，相关研究结论不一致^[23]。中国武汉市的一项病例对照研究以826例GDM孕妇与858例非GDM孕妇为研究对象，对VDR基因rs154410、rs7975232、rs731236、rs2228570、rs739837共5个SNP位点进行基因分型，结果发现其多态性与GDM无关联^[29]。中国南京市的一项出生队列研究选取964例GDM和1 021例正常孕妇为研究对象，对VDR基因rs4341603、rs7136534、rs739837共3个SNP位点进行基因分型，发现这3个基因多态性与GDM无关^[30]，本研究也发现rs7136534多态性与GDM无关。中国安徽省马鞍山市的一项出生队列研究对VDR基因rs1544410和rs731236共2个SNP位点进行基因分型，发现其多态性与该地区GDM发病有关^[31]。Apaydin等^[32]在土耳其人群中采用病例对照研究，选取100例GDM孕妇和135例正常孕妇分析VDR基因rs15444410、rs7975232、rs19735810和rs731236位点多态性与GDM的关系，结果发现rs1544410位点多态性与当地GDM的发病无关，与本研究结果一致。伊朗的一项病例对照研究分析了孕妇群体中VDR基因rs7975232和rs731236位点多态性与GDM的易感性之间的关联，结果发现这2个SNP位点与GDM之间存在关联^[33]。各研究结论不一致可能与种族差异、样本量大小以及混杂因素的控制等有关。

VDR基因4个SNP（rs7967152、rs2238140、rs2853564、rs2853566）都是VDR的内含子SNP，为了预测其生物学功能，进一步采用ESEfinder来验证突变是否会导致剪接因子结合位点的改变^[34]。结果发现，rs7967152可能导致SRp40结合位点的改变，rs2238140可能改变SF2/ASF、SRp55剪接结合位点，而rs2853564可能改变SF2/ASF、SRSF1（IgM-BRCA1）剪接结合位点。这些改变的剪接结合位点可能诱导剪接转换或外显子跳跃，随后通过改变转录影响蛋白质的合成^[35]。尚未发现rs2853566可以改变RNA剪接的结合位点，其功能有待进一步研究。

本研究存在局限性。对于文化程度、产次等因素已有研究表明其是GDM的危险因素，但是在本研究中这些因素在病例组与对照组之间分布均衡，所以未对其进行控制，可能存在对混杂因素的控制不足。虽然本研究是以医院为基础的病例对照研究，但是研究对象来自两年以上的出生队列，且研究人群中的GDM发病率（15.8%）在中国人群GDM发病率（14.8%~17.6%）范围内^[2-3]。本研究结果尚需在不同人群中进行交叉验证，并需要进一步的功能验证。

综上所述，本研究发现中国中部人群中VDR基因rs7967152、rs2238140、rs2853564、rs2853566位点多态性及区块（rs1544410、rs7967152）GC单倍型与GDM的发病风险升高有关。VDR基因多态性与GDM的关系可能为GDM的预防提供新的思路，通过VDR的基因分型可以找到易感GDM的人群，从而提供有针对性的维生素D补充建议，具有潜在的科学和临床意义。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  李金波：分析/解释数据、统计分析、论文撰写；郭孟竹、任庆文：实施研究、采集数据；李汪俊：采集数据、分析/解释数据；冯永亮、杨海澜：酝酿和设计实验、研究指导；张亚玮、王素萍：酝酿和设计实验、研究指导、论文修改；邬惟为：酝酿和设计实验、研究指导、论文修改、经费支持