艰难梭菌（Clostridioides difficile）是引起抗生素相关性腹泻的重要病原。近年来，艰难梭菌感染（Clostridioides difficile infection，CDI）成为医院获得性腹泻的主要病因，已在欧、美洲地区国家引发多起暴发流行，被列为紧迫的公共卫生威胁之一^[1]。我国CDI呈快速增长趋势，腹泻患者中产毒艰难梭菌的检出比例高达14%^[2]。艰难梭菌的主要致病机制是由tcdA和tcdB基因编码的肠毒素A和细胞毒素B引起，二者与调节基因tcdC、tcdR、tcdE共同构成致病决定区基因座；部分艰难梭菌可产生二元毒素，由cdtA和cdtB基因编码，也与其致病作用密切相关^[3-4]。

目前的研究结果表明，中国CDI特征存在地域和人群的分布差异。2009-2016年，我国浙江省及东部和东南部医院分离得到的艰难梭菌分子型绝大多数来自clade 1群，其次是clade 4群和clade 5群，其中序列型（ST）35、ST3、ST37和ST54为主要型别^{[2, 5-9]}。本课题组在2013-2016年曾对昆明地区978例腹泻患者的CDI特征进行了分析，其中腹泻患者粪便艰难梭菌内参基因阳性检出率为14.11%，ST35、ST54和ST3为主要型别^[10]。本研究探讨艰难梭菌在本地区腹泻人群中不同监测年度的异同点，为艰难梭菌的防治提供基础数据。

资料与方法

1. 资料来源：2018年7月至2020年11月，对云南省4家哨点医院腹泻患者粪便标本共388份进行艰难梭菌的检测。腹泻患者均为医院初诊病例。哨点医院A和B为昆明市的三甲综合医院；哨点医院C为昆明市三甲儿童医院；哨点医院D为昆明市社区卫生服务中心。所有的腹泻标本既往已经开展腹泻类病毒（轮状病毒、札如病毒、诺如病毒、腺病毒、星状病毒）和细菌病原谱（致泻性大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、弯曲菌、耶尔森菌）的检测。

2. 粪便标本中艰难梭菌内参基因和毒素基因检测：采用粪便基因组DNA提取试剂盒（北京天根，DP328）对388份粪便标本进行DNA提取，艰难梭菌多重荧光PCR检测试剂盒（圣湘生物，0101060133）对提取的DNA同时进行tcdA、tcdB、cdtB和tpi（内参基因）的测定。

3. 菌株的分离和鉴定：将艰难梭菌内参基因阳性的粪便标本接种在选择性环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂平板（CCFA）上，37 ℃厌氧培养48 h。从CCFA上挑取黄色、摊鸡蛋样菌落转种在脑心浸液（BHI）培养基上，37 ℃厌氧培养24 h，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行鉴定。将鉴定为艰难梭菌的菌株再次转种于BHI培养基上进行纯化，提取艰难梭菌菌株的基因组DNA，进行tcdA、tcdB、tcdC、tcdR、tcdE、cdtA和cdtB基因的PCR检测^[10]。根据《艰难梭菌感染诊断》（T/CPMA 008-2020），tcdB+表示样本中存在产毒艰难梭菌，本研究以tcdB+为标准，进一步分析tcdB+与其他因素之间的关系。

4. 多位点序列分型（MLST）：PCR扩增艰难梭菌的7个管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA和tpi），将PCR产物进行双向测序（硕擎）。采用DNAStar 7.0软件对测序结果进行拼接，与数据库（https://pubmlst.org/organisms/clostridioides-difficile）进行比对，得到所测的基因位点等位基因号以及ST^[10]。

5. 统计学分析：采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。单因素分析采用χ²检验或Fisher确切概率法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

1. 基本情况：388例腹泻患者中，男性245例（63.14%），女性143例（36.86%）；≤5岁的患者214例（55.15%），6~岁21例（5.41%），19~岁83例（21.40%），≥60岁70例（18.04%）；腹泻天数≤5 d患者279例（71.91%）；水样便患者316例（81.44%），其次为黏液便43例（11.08%）和脓血便29例（7.48%）；发热和脱水患者较少。

2. 艰难梭菌毒素基因分析：388份粪便标本中，艰难梭菌内参基因tpi阳性标本47份，总阳性率为12.11%，其中非产毒标本4份（8.51%），产毒标本43份（91.49%）。产毒标本中，tcdA+ 34份，tcdB+42份，二者均为阳性的为33份；tcdA+tcdB-1份，tcdA-tcdB+ 9份。

tcdB+结果与患者年龄差异有统计学意义（χ²=17.52，P=0.001），≤5岁患者的tcdB+比例最高（54.76%），其次为≥60岁患者（38.10%）；与就诊前发热差异有统计学意义（χ²=3.90，P=0.048），除此之外，与其他临床特征差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 1。

3. 菌株分离和MLST结果：艰难梭菌内参基因阳性标本47份中分离得到18株艰难梭菌，阳性标本的分离率为38.30%。其中tcdA、tcdB、tcdC、tcdR和tcdE基因均为阳性的菌株为14株（77.78%），非产毒性艰难梭菌为4株（22.22%）。分离菌株的二元毒素均为阴性。

MLST结果显示，18株艰难梭菌菌株共形成10种ST，其中ST37型5株（27.78%）；ST129、ST3、ST54和ST2型各2株；ST35、ST532、ST48、ST27和ST39型各1株。

4. 艰难梭菌与其他病原共感染：tcdB+与任一病毒阳性共感染12例，其中轮状病毒7例、诺如病毒5例、腺病毒4例和星状病毒1例。艰难梭菌tcdB+与上述病原体间差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。

讨论

2013-2016年昆明地区的腹泻患者粪便艰难梭菌内参基因阳性检出率为14.11%^[10]，本研究的腹泻患者粪便艰难梭菌内参基因阳性检出率则为12.11%。在7年的监测时间内，艰难梭菌粪便毒素的检出率维持在较恒定的水平。此外，昆明地区的腹泻人群中分离到的艰难梭菌均未发现高产毒性艰难梭菌。

本研究发现2013-2016年分离得到的艰难梭菌以ST3、ST35和ST54为主要型别^[10]。本研究中分离得到了ST37型菌株，并成为优势克隆株，而ST3、ST35和ST54型的占比下降，这一现象反映了本地区艰难梭菌优势型的交替过程。在过去的20年里，世界各地陆续报道了由ST37型艰难梭菌引起的感染和暴发，从北美洲地区的加拿大到欧洲地区的荷兰和波兰等国家^[11]。该基因型也是亚洲许多国家的主要产毒菌株之一^[12]。一项针对ST37型艰难梭菌的全基因组研究显示，来自中国的ST37型菌株分为4个不同的亚系，与感染严重的相关分离菌株表现出更高的毒素表达水平^[11]。因此，加强该基因型艰难梭菌的监测对于中国艰难梭菌的防治工作具有重要意义。

病原体的共感染也是一种常见的现象，多见于临床相关报道^[13]。共感染加重了疾病的发病水平和严重程度，会对疾病病程和临床治疗产生较大影响，增加患者的疾病负担^[14]。有报道表明，临床上的多细菌共感染占25%，而儿童呼吸道病毒的共感染率则从1%到40%不等^[15]。部分共感染的临床研究结果显示，共感染患者较单一病原感染者临床症状更为严重，但是也有研究显示了相反的结果^[13]。本研究中，仅发现了艰难梭菌与致腹泻类病毒发生共感染的情况，如轮状病毒和诺如病毒等，未发现艰难梭菌与致腹泻类细菌的共感染情况。这种现象在本课题组2013-2016年监测期间的数据也有相关报道^[10]。关于艰难梭菌共感染是否会加重腹泻患者的临床症状和严重程度，目前尚不能得到相关结论，这也将会是后续艰难梭菌研究需要关注的领域。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  李桂满：实施研究、起草文章；古文鹏：实施研究、起草文章、统计分析；侯敏：采集数据、指导；贾森泉、王媛媛：实施研究；白璐璐、尹建雯：分析/解释数据；周永明：统计分析、指导；伏晓庆、卢金星：指导；吴媛：酝酿和设计实验、指导