A群链球菌（GAS）是一种常见的革兰阳性菌，人类是其唯一自然宿主，人体可正常携带GAS而不致病。GAS感染人体可引起咽峡炎、猩红热、肾小球肾炎等多种疾病。其中猩红热多见于儿童为我国最常见的GAS疾病。目前描述GAS分子分型常采用的方法为emm（encoding mature M protein gene）分型、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）和超抗原（SAg）基因检测等。本研究利用该4种分型方法对2013年山东省致猩红热及无症状携带者的GAS进行分子分型。 材料与方法

1. 实验菌株：源自2013年1－12月山东省济南、青岛、淄博、潍坊市猩红热和无症状携带者的咽拭子样本。

2. 分离与鉴定：咽拭子标本接种于5%羊血培养基，置37 ℃含50 ml/L的CO₂培养箱中培养24 h。采用杆菌肽试验（OXOID公司）和链球菌分组诊断试剂（OXOID公司）鉴定可疑菌落。

3. 分型方法：

（1）emm：按照美国疾病预防控制中心网站（CDC：http：//www.cdc.gov/streplab/protocol-emm- type.html）的方法进行菌株DNA提取及PCR扩增，委托华大基因研究中心测序，其结果上传至http：//www.cdc.gov/streplab/strepblast.html进行序列比对，确定emm型别。

（2）MLST：根据MLST网站（http：//spyogenes.mlst.net/）的方法，对GAS的管家基因（gki、gtr、muri、muts、recp、xpt、yiql）进行PCR扩增，委托华大基因研究中心测序。利用BioNumeric 6.6软件对序列拼接及上传MLST数据库进行比对，确定ST型别。

（3）SAg基因：对speA、speC、speG、speH、speI、speJ、speK、speL、speM、smeZ、ssa共11种SAg基因进行PCR扩增^[1]，speB作为阳性对照，毛细管电泳（QIAGEN公司）检测GAS中SAg基因的携带情况。

（4）PFGE：GAS染色体DNA以smaⅠ（TaKaRa公司）酶切，H9812以XbaⅠ（TaKaRa公司）酶切，根据Tenover等^[2]推荐的标准利用BioNumerics 6.6软件分析PFGE凝胶图谱。

4. 统计学分析：利用SPSS 19.0软件分析数据，定性资料分析采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 结果

1. 样本概况：440份样本共检出72株GAS（表 1）。

表 1 2013年山东省4个监测点GAS菌株采样及检出情况

表选项

2. emm型别：72株GAS中，emm1型30株（41.67%），emm12型41株（56.94%），emm227.1型1株（1.39%），其亚型分布见表 2。emm1和emm12型在性别、年龄（＜5岁和6～10岁）及地区（济南、青岛）分布上，差异无统计学意义（P＞0.05）。6名无症状GAS携带者的emm型别均为emm12，其中5株为emm12.0，1株为emm12.19（表 2）。

表 2 2013年山东省72株GAS的emm型别分布

表选项

3. 型别关联分析：

（1）ST与emm：共检出ST28型（31株，43.06%）和ST36型（41株，56.94%）两种ST型别。对emm与ST型别进行关联性分析，emm1与ST28型相关（P＜0.05），而emm12与ST36型相关（P＜0.05）。

（2）SAg与emm：speA、speC、speG、speH、speI、speJ、smeZ、ssa的检出率分别为38.89%、95.83%、97.22%、 38.89%、54.17%、41.67%、100.00%、100.00%，未检出speK、speL、speM。72株GAS可分为13种SAg基因谱，命名为profile1～ profile13（表 3）。其中profile1型和profile2型为主要SAg基因谱型，分别为26株（36.11%）和21株（29.17%）。对emm1、emm12与speA、speH、speI、speJ进行关联性分析，发现emm1型菌株倾向于含有speA、speJ，不含speH、speI（P＜0.05）；emm12恰好相反，倾向于含有speH、speI，不含speA、speJ（P＜0.05）。

表 3 2013年山东省72株GAS的SAg基因谱分布

表选项

（3）PFGE与emm：对72株GAS的聚类结果做树形图分析（图 1），共得到A～T 20种凝胶图谱。B、C、D、L包括47株GAS（65.28%），为主要的PFGE型别。其中L包括22株GAS（30.56%），为山东省GAS菌株PFGE的优势型别，涉及地区包括济南、青岛、潍坊。结果按70%相似性区分，主要分为甲、乙两组（图 1）。甲组对应的emm型别除1株为emm227，其余均为emm1；乙组对应的emm型别均为emm12。提示GAS的PFGE与emm之间可能存在一定的关联。

图 1 2013年山东省72株GAS的PFGE聚类分析

图选项

目前（截至2014-05-08）emm数据库中已发现并命名有245种emm型别，1 200多种亚型^[3]。一项世界范围内GAS的emm分型的Meta分析显示，全球GAS主要emm型别为emm1和emm12^[4]。但可能由于地理环境、生活习惯、宿主免疫水平等原因，其又表现出一定的地域差异。如印度的emm型别主要为emm11^[5]；新西兰主要为emm1、emm89、emm12^[6]；我国北京地区主要型别为emm12和emm1^[7]。本研究表明，2013年山东省致猩红热及无症状携带者的GAS优势型别也为emm1和emm12，符合全球及我国的emm型别分布特点。但同时emm型别分布较为单一，仅检出3种emm型别（emm1、emm12和emm227）、12种亚型。其中致猩红热GAS中emm1（37.88%）和emm12（42.42%）占绝对比例，提示目前致猩红热的GAS防制重点应为emm12和emm1。而6株无症状携带者GAS的emm型别均为emm12，由于菌株量少，难以确定无症状携带者中emm型别分布。

贵州地区一项有关致急性肾小球肾炎GAS的ST型别为ST53和ST426^[8]，而一项北京和重庆两地的研究则发现5种型别（ST36、46、150、37、38）^[9]。本研究仅发现2种ST型别（ST28和ST36），少于国内外其他地区报道。北京和重庆两地研究中，emm12对应的ST型别为ST36^[9]，日本的研究中92.56%的emm1表现为ST28，97.70%的emm12表现为ST36^[10]，同本研究一致，提示emm型别与ST型别间存在一定的联系。另外，有文献认为在咽部感染的GAS中，emm型别与ST型别关联性强，而在皮肤感染的GAS中，其关联性较弱^[11]。 　

SAg基因的阳性率普遍较高，但speK、speL、speM未有检出，这与2011年我国北京地区的研究结果基本一致，其中speA、speH、speI、speJ略有差别^[12]。本研究未检测speF，而在欧洲诸国，speF的检出率均高达100%^{[13, 14, 15, 16, 17]}；在印度speF检出率明显较低（59.70%）^[18]；我国广东地区speF检出率为100%^[19]。另外，本研究emm1型菌株大多含有speA、speJ，不含speH、speI。emm12恰好相反，倾向于含有speH、speI，不含speA、speJ。这与以往文献报道相一致^[1]。有研究显示emm1和emm12通常不含有speK、speL、speM^[1]，与本文一致。然而，也有文献认为emm1和emm12中通常不含有ssa^[1]，与本文相悖。

PFGE作为病原菌分型的“金标准”，在流行病学溯源和传染病监测中有很好作用。本研究中，各地区（除潍坊）均存在多种凝胶图谱，提示猩红热以散发为主；其中以D和L型最为普遍（48.61%），建议在GAS动态监测中注意该PFGE型别的变化。

综上所述，2013年山东省致猩红热和无症状携带者的GAS在分子型别分布上较为单一，emm型别以emm1和emm12为主，ST型别仅有ST28和ST36，SAg基因携带率普遍较高（除speK、speL、speM）。