文章信息
- 蒋幼芳, 梅瑾, 张闻, 钱霞, 张甦, 刘春玲, 杨华.
- Jiang Youfang, Mei Jin, Zhang Wen, Qian Xia, Zhang Su, Liu Chunling, Yang Hua.
- 母亲MTHFR 677C/T多态性和孕期状况与子代发生先天性心脏病的相关性研究
- Correlation between offspring congenital heart disease and MTHFR 677C/T polymorphism and general status of pregnant women
- 中华流行病学杂志, 2015, 36(10): 1072-1076
- Chinese Journal of Epidemiology, 2015, 36(10): 1072-1076
- http://dx.doi.org/10.3760/cma.j.issn.0254-6450.2015.10.008
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文章历史
- 投稿日期: 2015-03-06
2. 杭州市第一人民医院集团杭州市妇幼保健院;
3. 湖州市妇幼保健院
2 Hangzhou Obstetrics and Gynecology Hospital;
3 Huzhou Maternity and Child Hospital
先天性心脏病(CHD)是导致围产儿和婴幼儿死亡的主要原因,是最常见的出生缺陷之一,Burki和Babar[1]报道CHD在出生儿中总发病率约为4‰~50‰,我国出生缺陷监测结果显示,CHD发生率已位居我国主要先天畸形的第三位,仅次于神经管缺陷和唇腭裂,人群发病率约为8‰[2]。CHD病因复杂尚未完全阐明,但多数学者认为,除了少数CHD是单基因突变和染色体畸变引起,大多数CHD是由遗传因素和环境因素相互作用引起的多基因遗传病[3]。本研究采用病例对照研究,选择100对有CHD和无CHD胎儿的生物学母亲为研究对象,收集生物学母亲怀孕期间的环境相关状况、优生认知、叶酸制剂/微量元素制剂补充情况,结合血清同型半胱氨酸(HCY)、叶酸、VitB12以及HCY代谢关键酶(MTHFR 677C/T)基因多态性检测,从环境、营养、认知、基因多角度来探讨各因素在CHD发生中的关系,为CHD病因研究和干预提供理论和实验室依据。 对象与方法
1. 研究对象:2013年3月至2014年5月,收集在杭州市级某医院和湖州市某妇幼保健院就诊检查的孕妇,经彩色多普勒超声心动图、临床会诊确诊为先天性心脏病(根据出生缺陷监测的23种疾病诊断标准,包括单纯性先天性心脏病和多发畸形中的先天性心脏病)的胎儿生物学母亲100例为病例组;收集同期同医院经临床、B超检查诊断无先心病及其他畸形的同性别同孕龄的胎儿生物学母亲100例为对照组,病例组和对照组的生物学母亲经心脏听诊均无器质性杂音,询问病史均无先天性心脏病家族史。
2. 研究方法:自行设计《围产儿母亲生殖健康KAP问卷》,由受过专职培训的调查员对病例组及对照组的生物学父母进行访谈式问卷调查,调查前向父母提供知情同意书并获签字,保证信息的可靠性和完整性。调查内容包括围产儿一般情况(性别、孕龄、发现CHD时间、CHD类型等),父母一般情况(年龄、教育程度、常住地、民族、职业、家庭年收入、生育史、流产史、既往患病史、先天畸形家族史等),母亲孕前孕期情况(两免参加情况、叶酸制剂及微量元素制剂补充情况、各种食物摄入情况、精神状态、孕早期感冒发热情况、妊娠合并症、宠物接触情况、服药史、X射线接触情况,农药接触情况、吸烟情况、饮酒情况等)、优生知识掌握情况等。调查结束后采集病例组和对照组生物学母亲肘前静脉血7 ml,2.0 ml静脉血置EDTA-K2抗凝管,5 ml静脉血置促凝管于4 ℃下1 h内3 000 rpm/min离心5 min分离血清,全血和血清样本均置-80 ℃冰箱冻存备用。
3. 实验室检测:① MTHFR 677C/T基因检测采用全血DNA提取试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司SK8224],MTHFR 677C/T检测采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction restricted fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技术。上游引物为5′-CATCCCTCGCCTTGAACAG-3′,下游引物为5′-AACAAACCCCTCAACAGACACT-3′。引物由上海生物工程技术公司合成。PCR反应扩增仪(加拿大BBI公司),PCR反应体系总体积15 μl,包括PCR mix,模板和引物。PCR扩增条件:95 ℃ 预变性5 min,20次循环(95 ℃变性30 s,68 ℃复性45 s,72 ℃ 延伸60 s),再20次循环(95 ℃变性30 s,58 ℃复性30 s,72 ℃ 延伸60 s ),72 ℃终末延伸6 min,4 ℃保存。PCR扩增产物经过限制性内切酶Hinf Ⅰ酶切处理,然后对酶切后的PCR产物片段用3%的琼脂糖凝胶电泳分离,150 V电泳30 min,快速银染法显色,根据不同电泳条带类型确定基因型。②血清HCY、叶酸、VitB12检测采用美国雅培Ci8200全自动生化免疫分析仪定量测定HCY,用罗氏Cobas E602全自动电化学发光分析仪检测叶酸和VitB12,试剂为仪器配套试剂。
4. 统计学分析:共整理100对病例组和对照组完整资料,输入SPSS数据窗口,经检查无逻辑错误,用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料组间比较用t检验或F检验,计数资料用χ2检验,采用非条件logistic逐步回归进行多因素分析,以P<0.05为差异有统计学意义。 结果
1. 一般情况及遗传平衡检验:病例组100例,生物学母亲年龄21~47岁,平均(28.1±4.46)岁;对照组100例,生物学母亲年龄19~40岁,平均(28.2±2.98)岁,两组人群年龄差异无统计学意义(t=-0.19,P=0.849),两组人群民族构成差异无统计学意义(χ2=0.33,P=0.567)。Hardy-Weinberg遗传平衡检验表明,病例组(χ2=0.13,P>0.05),对照组(χ2=0.30,P>0.05),样本具有较好的群体代表性。
2. MTHFR 677C/T基因型和等位基因比较:病例组MTHFR 677位点CC、CT、TT基因型频率分别是38.0%、46.0%、16.0%,对照组MTHFR 677位点 CC、CT、TT基因型频率分别是41.0%、48.0%、11.0%,病例组和对照组MTHFR 677C/T基因型频率比较差异无统计学意义(χ2=1.08,P=0.582)。 病例组MTHFR 677位点C等位基因、T等位基因分别是123例(61.5%)、77例(38.5%),对照组MTHFR 677位点C等位基因、T等位基因分别是130例(65.0%)、70例(35.0%),病例组和对照组MTHFR 677C/T等位基因频率比较差异无统计学意义(χ2=0.53,P=0.468)。见表 1。
3. 血清HCY、叶酸、VitB12水平与不同MTHFR 677C/T基因型比较:病例组血清HCY水平[(10.13±2.71)μmol/L]高于对照组[(7.38±2.01)μmol/L],两组差异有统计学意义(t=-8.14,P=0.000),不同MTHFR 677C/T基因型血清HCY水平比较,差异无统计学意义(F=0.85,P=0.430)。病例组和对照组血清叶酸水平比较差异无统计学意义(t=0.63,P=0.530),不同MTHFR 677C/T基因型血清叶酸水平比较,差异无统计学意义(F=2.15,P=0.119)。血清HCY水平和血清叶酸水平进行Pearson相关分析呈负相关关系(r=-0.28,P=0.000)。病例组血清VitB12水平(208.83±77.19)pmol/L低于对照组血清VitB12水平(239.05±121.93)pmol/L,两组差异有统计学意义(t=2.09,P=0.038),不同MTHFR 677C/T基因型血清VitB12水平比较,差异无统计学意义(F=1.29,P=0.277)。血清HCY水平和血清VitB12水平进行Pearson相关分析呈负相关关系(r=-0.24,P=0.001)。见表 2。
4. CHD发生的单因素分析:对30个CHD可能危险因素进行单因素分析,分类变量χ2检验,定量变量t检验,赋值为子代先天性心脏病(有=1/无=0)、职业(无固定职业家务务农=1/其他=0)、常住地(农村乡镇=1/城市=0)、年收入(3万~5万元及以下=1/5万~10万元及以上=0)、教育程度(高中或中专及以下=1/大专及以上=0),MTHFR 677基因型(TT=1/ CC+CT=0),经常摄入各类食物(无=1/是=0),其他环境因素(是=1/无=0),定量变量不变,结果母亲教育程度、常住地、职业、孕前孕期房屋装修、患慢性病情况、接触农药化肥油漆印刷、食用鱼虾肉蛋豆制品、食用蔬菜水果、食用奶制品、优生认知得分、血清HCY水平、血清VitB12水平、父亲教育程度、家庭年收入14个因素有统计学意义(P<0.05)。见表 3。
5. CHD发生的多因素非条件logistic逐步回归分析:子代CHD发生作为因变量,将30个危险因素进行多因素非条件logistic逐步回归分析,采用偏最大似然估计后退法对变量进行逐步筛选,选入标准α=0.05,剔除标准α=0.05,建立回归方程,经模型似然比检验有显著性意义(χ2=117.42,P=0.000),结果显示:母亲教育程度、家庭年收入、异常生育史、患慢性病情况、优生认知得分、血清HCY水平6个变量进入回归方程(P<0.05)。见表 4。
6. CHD发生危险因素logistic相乘模型交互作用分析:MTHFR 677TT基因型与CHD风险的OR=1.541(95%CI:0.676~3.512),将进入回归方程有统计学意义的6个因素(母亲教育程度、家庭年收入、异常生育史、患慢性病情况、优生认知得分、血清HCY水平)分别与MTHFR 677TT基因型作为交互变量对CHD发生与否进行logistic相乘模型交互作用分析,OR值及其95%CI分别为2.812(0.724~10.924)、1.702(0.396~7.321)、2.579(0.488~13.617)、0.320(0.063~1.624)、1.002(0.954~1.053)、1.100(0.995~1.217)。 讨论
以往研究认为MTHFR 677位点纯合突变TT基因型是先心病的危险因素,MTHFR 677TT基因型携带者患CHD的风险是MTHFR 677位点CC+CT基因型的3.437倍[4, 5],也有研究结果提示母亲或父亲MTHFR 677C/T多态性与CHD发生并无关联[6],MTHFR 677C/T多态性与CHD发生关系尚无统一结论。本研究显示MTHFR 677C/T基因型和等位基因构成病例组和对照组比较差异无统计学意义(χ2=1.08,P=0.582;χ2=0.53,P=0.468),未发现MTHFR 677C→T 突变与CHD发生存在关联。有资料显示在我国不同地区不同民族MTHFR基因也存在明显差异[7],这种差异导致不同地区不同种族人群对MTHFR基因相关疾病易感性也存在差异。因此,需扩大样本量了解不同地域不同民族MTHFR基因多态性分布情况并进行与CHD等MTHFR基因相关疾病的关系研究。
本研究发现血清HCY水平与CHD发生存在关联(t=-8.14,P=0.000),CHD多因素logistic回归分析显示血中高HCY可增加CHD发生的可能性(OR=1.734,95%CI:1.458~1.986),与既往研究结果一致[8, 9, 10, 11, 12]。血清HCY水平升高主要受遗传和营养因素影响,有研究发现MTHFR 677C/T基因突变是引起HCY水平改变的主要遗传因素,两者呈正相关关系[13, 14]。本研究显示不同MTHFR 677C/T基因型血清HCY水平差异无统计学意义(P>0.05),但从表 2可以看出血清HCY水平TT>CT>CC,与文献报道一致[15]。血清HCY水平与血清叶酸水平呈负相关关系(r=-0.28,P=0.000);血清HCY水平和血清VitB12水平呈负相关关系(r=-0.24,P=0.001)。既往研究认为叶酸是血浆HCY代谢途径中重要的甲基供体[16],VitB12参与甲基供体转移,叶酸/VitB12缺乏使HCY不能甲基化为蛋氨酸,从而导致高HCY血症,本次研究也支持这个结论。母亲叶酸制剂和VitB12制剂的补充可以提高母亲血清叶酸水平和VitB12水平从而预防高HCY血症出现,对子代CHD的发生起到间接预防作用。
本研究显示母亲教育程度低可以增加CHD发病风险(OR=3.386,95%CI:1.279~8.961),而优生认知得分高可以减少CHD发生的风险(OR=0.906,95%CI:0.836~0.981),说明教育可以提高人们对CHD疾病的认识,提高自我保护意识,从而采取有效的防范措施做到事先预防,这符合健康教育的知-信-行模式,因此对育龄妇女做好孕前孕期出生缺陷优生优育知识的宣教工作非常重要,是减少CHD发生的有效措施。母亲孕期患慢性病是子代患CHD的保护因素(OR=0.343,95%CI:0.134~0.881),本次调查中孕期所患慢性病主要是指糖尿病、甲状腺疾病、慢性肾炎、贫血等,其中以贫血为主。多数学者认为孕期患慢性病不仅疾病本身可导致自身激素、营养等方面的改变而干扰胎儿生存环境,对胎儿生长发育产生不良影响,而且慢性病往往需要服药治疗,已经证实可导致出生缺陷的药物有:激素类药物、解热镇痛抗炎药以及某些心血管药物等[16]。本次研究结果与既往研究结论不一致,各个体情况复杂,慢性病与CHD的关系有待进一步研究。
本研究显示有异常生育史可增加子代发生CHD的风险(OR=3.710,95%CI:1.217~11.308),与已有研究结论一致[17]。本次研究列入的异常生育包括死胎死产和自然流产,有学者认为自然流产和死胎是对有缺陷胎儿的自然淘汰[18],大多是由遗传基因缺陷引起。因此对有异常生育史的育龄妇女要做好孕前遗传咨询和产前筛查工作以预防各类先天性疾病患儿的出生。家庭年收入低的孕母人群OR值在各危险因素中最高(OR=8.699,95%CI:2.177~34.765),究其原因可能是由于家庭经济原因导致孕母得不到很好的孕前孕期保健医疗服务和营养支持,在其他文献中有关于居住在农村的妇女是CHD发生的危险因素[15],本研究单因素分析居住地与CHD发病有统计学意义,多因素分析居住地未进入回归方程(P>0.05),CHD各危险因素中显示家庭年收入对孕母CHD发生影响更大,因此在预防CHD发生中应更关注低收入人群。
本研究结果显示MTHFR 677TT基因型与各危险因素相乘交互作用后均无统计学意义(P>0.05),MTHFR 677TT基因型与CHD发病的关联强度OR值为1.541(95%CI:0.676~3.512),说明本次研究人群MTHFR 677TT基因型不是CHD发病的危险因素,生物学交互作用是指两因素皆为病因的前提下在疾病发生的生物机制上相互联系,包括协同作用和拮抗作用[19]。
随着人类基因组测序的完成,下一代基因组测序技术的出现并日益发展成熟,检测费用的下降,将有可能对CHD病例进行全基因组测序,进一步促进对CHD未知致病基因的发现,与环境因素的交互作用分析,也为CHD的病因学预防提供理论依据。
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