宫颈癌是女性生殖器官最常见的恶性肿瘤。叶酸具有维持DNA甲基化状态，抑制肿瘤细胞中癌基因表达，从而阻断癌症发生和发展的功能。本研究前期对叶酸与宫颈癌关系进行的Meta分析结果表明，低叶酸水平可能增加宫颈癌的发病风险^[1]。感染高危型人乳头瘤病毒16 型（HPV16）是宫颈癌发生的主要病因^[2]，HPV E6和E7是致癌蛋白编码基因，其编码的蛋白可分别通过抑制抑癌基因p53和视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）使被感染的细胞无限增殖并发生恶性转变。有研究表明HPV16 E6/E7 mRNA高表达与宫颈癌的发生有关^[3]。叶酸缺乏可增加HPV整合于宿主DNA的风险^[4]，且叶酸具有维持DNA甲基化状态从而抑制肿瘤细胞中癌基因表达的作用，进而推测叶酸可能通过影响HPV16 E6/E7 mRNA的表达对宫颈癌变产生影响，但目前未见相关报道。本次对不同宫颈病变患者进行研究，探讨叶酸和HPV16 E6/E7 mRNA表达与宫颈癌变的关系及两者在宫颈癌变中的交互作用，为宫颈癌病因和发病机制的研究提供科学依据。

1. 研究对象：选取2009年9月至2010年12月在山西省肿瘤医院、山西医科大学第二医院、太原市妇幼保健院以及介休市妇幼保健院经病理学确诊的宫颈鳞状细胞癌（SCC）患者64例、低度宫颈上皮内瘤样变（CIN1）患者55例、高度宫颈上皮内瘤样变（CIN2+）患者55例以及正常宫颈（NC）者80例作为研究对象。所有研究对象均排除营养性巨幼细胞性贫血、溶血性疾病、消化系统疾病、其他肿瘤患者以及近3个月内B族维生素使用者，并获得知情同意。采用面对面方式收集研究对象的人口学特征、生活习惯和生殖情况等资料，同时采集全部研究对象入院后、系统治疗前清晨空腹静脉血（抗凝血和非抗凝血）5 ml，并在手术或阴道镜检查中采集宫颈组织。所采集的生物样品均置于-80 ℃贮存待检。

2. 实验方法：

（1）检测HPV16的感染状态：采用酚-氯仿-蛋白酶K法在宫颈组织中提取总DNA，参照本研究前期建立的PCR扩增方法^[5]进行HPV16 DNA的扩增，确定HPV16的感染状态，以E2或E6任一片段阳性均可判定为HPV16阳性。

（2）测定血清叶酸和红细胞叶酸水平：用1%抗坏血酸溶液处理血清和全血样本，离心取上清，-20 ℃保存。将干酪乳酸杆菌L-casei（ATCC7469）接种于装有乳酸杆菌肉汤培养基的试管中，增菌纯化后用5 ml生理盐水悬浮，制成菌悬液。参照本研究前期建立的方法^[6]检测血清叶酸和红细胞叶酸的浓度。

（3）检测HPV16 E6/E7 mRNA的表达水平：取50 mg冻存宫颈组织剪碎后采用Trizol法提取宫颈组织中的总RNA。参照本研究前期建立的real-time PCR^[7]检测HPV16 E6/E7 mRNA的表达水平。HPV16 E6引物：上游5′-GCG ACC CAG AAA GTT ACC ACA-3′，下游5′-GCA TAA ATC CCG AAA AGC AAA G-3′（120 bp）；HPV16 E7引物：上游5′-CAG AGG AGG AGG ATG AAA TAG ATG- 3′，下游5′-CAC AAC CGA AGC GTA GAG TC- 3′（97 bp）；β-actin引物：上游5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′，下游5′-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3′（186 bp）。采用 2^-ΔΔct值（ΔΔCt：[（Ct_目的基因-Ct_β-actin）_实验组-（Ct_目的基因-Ct_β-actin）_NC组]）计算每个样本中HPV16 E6/E7 mRNA的相对表达量。2-ΔΔct值越大，表示mRNA表达水平越高。

3. 统计学分析：利用SPSS 16.0软件进行相关资料的χ²检验、方差分析、Welch检验、Kruskal-Wallis H检验、Spearman秩相关分析，采用有序多分类logistics回归进行OR值及调整OR（aOR）值的计算，应用相加模型和交互作用指标超额相对危险度（RERI）、交互作用归因比（AP）、交互作用指数（SI）及其95%CI进行交互作用定性和定量评估。检验水准α=0.05。

1. 人口学特征：选取NC组（80例）、CIN1组（55例）、CIN2+组（55例）、SCC组（64例）共254例为研究对象。各组研究对象在年龄、文化程度、职业、妇科病史、人工流产史、洗澡频率、洗阴频率、性生活后清洗等因素方面的差异均有统计学意义（P＜0.05)，见表 1。在民族、出生地、居住地、婚姻状况、吸烟、饮酒、肿瘤家族史等方面均衡可比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表 1 4组研究对象人口学特征及其相关因素

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2. 叶酸与宫颈癌变的关系：血清叶酸含量和红细胞叶酸含量均为非正态分布，经Kruskal-Wallis H检验，不同宫颈病变组血清和红细胞叶酸含量的总体分布差异有统计学意义（H=59.08，P＜0.001；H=43.68，P＜0.001）。调整检验水准α=0.008 3（α=0.05/比较次数=0.05/6），采用Bonferroni法进行两两比较显示，血清叶酸含量在NC组与CIN2+组和SCC组之间、CIN1组与CIN2+组和SCC组之间的差异均有统计学意义，其余各组间两两比较差异无统计学意义，CIN2+组和SCC组的血清叶酸含量低于NC组和CIN1组；红细胞叶酸含量在NC组与CIN2+组和SCC组、CIN1组与SCC组之间的差异有统计学意义，其余各组两两比较间差异无统计学意义，SCC组的红细胞叶酸含量低于其他各组（表 2）。进一步以NC组血清叶酸含量的50%点值（5.96 ng/ml）和红细胞叶酸含量的50%点值（275.42 ng/ml）为低叶酸水平的界值进行定性分析，显示随着宫颈癌变的进展，血清和红细胞叶酸水平均呈逐渐降低趋势（ χ²=32.71，P＜0.001； χ²=16.32，P＜0.001），利用有序多分类logistics回归以NC组为参照进行OR值和aOR值及其95%CI的计算（表 3）。经Spearman秩相关分析，血清叶酸和红细胞叶酸含量呈正相关（r=0.41，P＜0.001）。

表 2 4组研究对象血清叶酸和红细胞叶酸含量(ng/ml, M±Q_R)的比较

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表 3 4组研究对象血清叶酸和红细胞叶酸水平与宫颈病变的关系

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3. HPV16 E6/E7 mRNA表达与宫颈癌变的关系：HPV16 E6/E7 mRNA表达量均方差不齐，经Welch检验，HPV16 E6/E7 mRNA表达水平的总体分布在不同宫颈病变组差异有统计学意义（F=8.72，P＜0.001；F=13.53，P＜0.001）。采用LSD-t检验进行两两比较后显示，HPV16 E6/E7 mRNA表达量除在CIN1组与CIN2+组之间差异无统计学意义外，其余各组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05），且SCC组HPV16 E6/E7 mRNA表达量明显高于其他各组（表 4）。进一步以NC组HPV16 E6 mRNA表达量的均值（2.00）和HPV16 E7 mRNA表达量的均值（1.49）为高表达的界值进行分析，结果显示，HPV16 E6/E7 mRNA的表达水平随着宫颈癌变的进展均呈逐渐升高趋势（ χ²=30.11，P＜0.001； χ²=38.99，P＜0.001），采用有序多分类logistics回归以NC组为参照进行OR值和aOR值及其95%CI的计算结果见表 5。

表 4 4组研究对象HPV16 E6/E7 mRNA表达量(x±s)的比较

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表 5 4组研究对象HPV16 E6/E7 mRNA表达与宫颈病变的关系

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4. 叶酸缺乏与HPV16 E6/E7 mRNA高表达在宫颈癌变中的交互作用：本研究结果显示血清叶酸与红细胞叶酸之间存在正相关，鉴于红细胞叶酸用于反映机体叶酸的储存及营养状态较为稳定^[8]，故以红细胞叶酸作为衡量机体叶酸水平的指标进行后续分析。采用Spearman秩相关分析显示，宫颈病变患者总体红细胞叶酸含量与HPV16 E6/E7 mRNA表达量均呈负相关（E6：r=-0.14，P=0.009；E7：r=-0.21，P=0.001），见图 1。进一步以NC组红细胞叶酸含量的50%点值（275.42 ng/ml）和HPV16 E6/E7 mRNA表达量的均值（2.00，1.49）分别作为红细胞叶酸低水平和HPV16 E6/E7 mRNA高表达的界值，应用相加交互效应模型进行分析。结果显示，红细胞叶酸缺乏与HPV16 E6/E7 mRNA高表达在CIN1、CIN2+和SCC组均呈现正相加交互作用（SI值分别为1.68、4.48、6.24和1.09、2.68、6.85），且随着病变程度的加重其交互作用越强（表 6，7）。

图 1 4组病例红细胞叶酸（RBC-F）平均水平与HPV16 E6/E7 mRNA平均表达量的关系

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表 6 不同宫颈癌变组红细胞叶酸（RBC-F）水平与HPV16 E6 mRNA表达的交互作用

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表 7 不同宫颈癌变组红细胞叶酸（RBC-F）水平与HPV16 E7 mRNA表达的交互作用

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HPV16为迄今为止发现的致宫颈癌最常见的HPV高危亚型。HPV E6和E7基因为该病毒主要致癌基因，E6蛋白可与p53结合而阻断细胞凋亡，E7蛋白可与Rb结合使细胞无限增殖而癌变，因此HPV16 E6和E7高表达是p53和Rb失活的主要机制^[9]。对宫颈癌细胞系及宫颈癌组织样本的研究表明，E6/E7基因持续性表达是宫颈上皮细胞发生恶性转化以及发展为宫颈癌的必要条件^{[10, 11]}。HPV16 E6/E7 mRNA作为病毒癌基因表达的中间产物，表达异常升高可导致宿主细胞发生恶性转化^[12]。有研究显示，HPV E6/E7 mRNA在宫颈组织中表现癌基因活性^[13]，且表达水平与病变的严重程度相关^{[14, 15]}。本研究检测不同程度宫颈病变患者的HPV16 E6/E7 mRNA表达水平，显示随着宫颈病变程度的加重HPV16 E6/E7 mRNA表达水平逐渐升高，且SCC组明显高于其他各组。提示HPV16 E6/E7 mRNA高表达可增加宫颈癌及癌前病变发生的风险，是宫颈癌及癌前病变发生的危险因素，可作为宫颈病变的重要生物标志。HPV16 E6/E7mRNA作为代表HPV16基因功能状态的指标，在宫颈癌变的早期即可发生，因此HPV16 E6/E7 mRNA的高表达可作为宫颈癌的早期诊断标志并为预测病情提供依据。

叶酸是机体重要的微量营养元素，不能由机体自身合成，只能从膳食中摄取，故易产生缺乏。目前对于叶酸缺乏与宫颈癌关系的研究结论不尽一致，多数研究认为叶酸缺乏可增加宫颈癌发生的风险^[16]，然而也有研究并未发现两者间的关联性^{[17, 18]}。本研究前期发现，血清叶酸低水平与宫颈癌的发生有明显的关联^[19]，对体外宫颈癌细胞施加叶酸，均可提高细胞的增殖抑制率和凋亡率，可有效抑制宫颈癌细胞的生长^[20]。本研究显示，随着宫颈癌变的进展，血清叶酸和红细胞叶酸水平均逐渐降低，且CIN2+组和SCC组的血清叶酸含量明显低于NC组和CIN1组，SCC组的红细胞叶酸含量明显低于其他各组，再次提示血清叶酸和红细胞叶酸缺乏均可增加宫颈癌及癌前病变发生的风险，补充叶酸对预防宫颈病变具有重要的意义。本研究分析不同宫颈病变患者叶酸水平发现，机体叶酸缺乏出现在宫颈癌变的中后期，提示检测宫颈病变患者叶酸水平，可为预测和评估病变进展提供重要参考。

HPV与宿主细胞DNA整合是致癌过程的必要环节^[21]，而叶酸缺乏可增加这种整合的概率^[4]。叶酸可通过DNA甲基化维持基因组的稳定，从而调节基因的表达、抑制肿瘤细胞中癌基因的活化。有研究表明叶酸缺乏与HPV感染在宫颈癌变过程中存在协同作用^[6]，E6和E7作为HPV的致癌蛋白编码基因，提示叶酸缺乏可能诱导HPV E6和E7表达上调而增加宫颈癌的发生风险，但目前未见相关报道。本组前期的体外细胞学研究显示，随着叶酸干预浓度的增加宫颈癌细胞中HPV16 E6/E7 mRNA的表达量均呈降低趋势，尤其HPV16 E7 mRNA表达量下降明显^[22]。本研究从人群研究的角度对红细胞叶酸水平与HPV16 E6/E7 mRNA表达在宫颈癌变中的交互作用进行探讨，显示不同级别的宫颈癌变患者红细胞叶酸水平与HPV16 E6/E7 mRNA表达量均呈负相关，在CIN1、CIN2+和SCC组红细胞叶酸缺乏与HPV16 E6/E7 mRNA高表达均存在正相加交互作用。经交互作用定量分析显示，在CIN1、CIN2+和SCC组中由红细胞叶酸缺乏与HPV16 E6 mRNA高表达交互作用所引起的病例分别占28%、75%和81%，而由红细胞叶酸缺乏与HPV16 E7 mRNA高表达交互作用引起的病例分别占7%、60%和83%。提示机体红细胞叶酸缺乏与HPV16 E6/E7 mRNA高表达同时存在时，可增加宫颈癌及癌前病变发生的风险，尤其在宫颈癌变进展的后期更为明显，但其详细机制有待深入研究。

总之，本研究揭示了叶酸缺乏和HPV16 E6/E7 mRNA高表达均可增加宫颈癌及癌前病变发生的风险，当两者同时存在时表现为正相加交互作用，为深入了解宫颈癌进展的病因和发病机制提供了新线索，也可为宫颈癌诊断和预防提供重要理论依据。