联合国艾滋病规划署提出2020年实现“三个90%目标”，并在2030年终结艾滋病^[1]。要实现这一目标，就要找到HIV传染源，并分析传播特征和关联性，从而阻断传播链，这是遏制疫情的进一步扩大的关键。为了找到一种较为精确可行的，能分析HIV-1在人群中传播特征的方法，本研究以湖南省张家界市永定区老年HIV-1感染者为研究对象，结合分子生物学、流行病学、社会学方法，研究HIV-1在感染者间传播及感染地点的关联性，为精确预防干预提供参考。

1.研究对象：以2013-2015年张家界市永定区老年HIV-1感染者为研究对象，用自制统一问卷调查表，进行面对面现场访谈，收集人口学、行为学资料。同时，在湖南省CDC HIV确证实验室血浆库中，查询到当年首次检测CD₄⁺T淋巴细胞（CD₄）后保留的血浆样本，共计43人。排除条件：①已经接受过抗病毒治疗者；②自主拒绝接受访谈者；③已经死亡或者身体条件不允许接受访谈者。本研究通过湖南省CDC伦理委员会审查。

2.研究方法：

（1）核酸提取及目标片段的扩增、序列测定：使用美国雅培公司的m2000全自动病毒载量检测系统对43份血样进行病毒载量检测，对结果 > 10³拷贝/ml的样本进行HIV基因进化树分析。目的片段为pol区，长度约为1 300 bp（HXB₂位置：2 028~3 462），采用In-house方法，具体实验条件和方法参照文献[2-3]，两轮PCR后的产物经1%（质量分数）琼脂糖凝胶电泳确认扩增片段分子量正确后，将扩增产物送北京诺赛基因测序公司测序。

（2）亚型分析和构建系统进化树：序列用Contig Express和BioEdit软件进行拼接整理和校对，整理后的序列按照国内外学者提出的方法进行系统进化树分析^[4-6]。使用Mega 5.2软件构建系统进化树，选择Neighbor-Joining Tree法，Bootstrap method重复抽样次数设置为1 000。

（3）遗传距离的分析：选择Compute Pairwise Distances，在Model中选择Kimura 2-parameter，碱基替换为d：Transitions+Transversions，计算序列的校正遗传距离。

3.统计学分析：使用SPSS 18.0软件建立数据库并进行数据双录入，计数资料用构成比、率描述，计量资料用均数描述。

1.聚集簇分析：43份血样成功扩增到42条有效序列。其中，B亚型占80.95%（34/42），CRF01_ AE亚型占14.29%（6/42）、C亚型占4.76%（2/42）。研究组34条B亚型中有8簇共计19条序列Bootstrap检验值 > 80，形成明显聚集簇，有高度传播关联（图 1）。其中，YDQ30、YDQ32与参考株07_BC.CN.97.CN54 ACC AX149771重组亚型聚集，其余均与B.FR.83.HXB2-LAI-IIIB-BRU ACC K03455、B.TH.90.BK132 ACC AY173951聚集成簇。34条序列成簇率为55.89%（19/34），说明该地区B亚型感染者之间呈现高聚集性，且在小范围内传播，传播链具有封闭性。

图 1 湖南省张家界市永定区34条B亚型序列系统进化树

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2.遗传距离分析：选取34条B亚型序列和8个聚集簇中序列，分别计算序列的校正遗传距离与平均校正遗传距离，可得34条B亚型序列遗传距离均值为0.058 3，8个聚集簇中簇内遗传距离均小于34条B亚型序列的平均遗传距离（表 1），说明聚集簇内部序列具有高度的同源性。

表 1 8个聚焦簇校正遗传距离的比较

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3.簇内个人信息分析：8个聚集簇19名研究对象中，男性13名，自述有嫖娼史占84.62%（11/13），皆到过比较固定的暗娼点，且部分老年男性感染者有结伴嫖娼行为。男男性行为占15.38%（2/13），其高危行为发生点主要在录像厅、公园。6名女性中，承认卖淫者2人；自述无婚外高危史、配偶为HIV感染者4人。地点A在主城区，地处老街区，交通便捷，市内老年人常在周边活动，且卖淫女大部分居住此地。地点B位于城区西北方向的城郊，距主城区约35 km，交通相对闭塞，嫖客以本地人为主。聚集簇内的序列特征分布与感染者的高危行为史吻合，确证时间相距较近，明显形成具有传播关联的灶点分布。说明该地区老年人感染HIV-1 B亚型在地理位置和行为学方面有同源性（表 2）。

表 2 8个聚集簇内个案流行病学调查信息

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近年来艾滋病的溯源研究成为领域内研究热点^[7-9]。主要涉及非婚异性性行为传播溯源、家庭内传播溯源以及MSM传播溯源，赵琦等^[10]运用Miseq测序技术对一起疑似非婚异性性行为感染者进行溯源调查和分析。潘晓红等^[11]通过分子技术手段分析研究当地外来婚嫁女感染HIV亚型特征和家庭内传播溯源，发现HIV感染者中夫妻间和母子间有传播关系。Chen等^[12]结合分子流行病技术和数学模型对中国香港地区MSM人群B亚型毒株进行了溯源分析，提示大数据的挖掘利用在分子溯源领域有重要的应用价值。本研究侧重于对某区域内B亚型毒株的非婚异性性传播以及家庭内性传播关系的分析，在传播源头上进行干预，保证研究的高效性和可行性。

湖南省是HIV亚型比较多的省份之一^[13]。既往研究发现，在张家界市的HIV感染者中，HIV-1 B亚型明显高于省内其他地区，尤其是近年老年人HIV-1感染者，呈现出一定的聚集性和封闭性特点。HIV-1 B亚型是人类首次分离到的亚型^[14-16]，我国最早出现在90年代中部地区有偿献血HIV-1感染者中^[17-18]。针对张家界市这一特点分析，与该地处于湘西少数民族地区，经济落后，交通闭塞，人员流动小，性观念较开放，并且1995年该地报告的首批感染者为赴河南有偿卖血的农民，而引入B亚型毒株有关。通过对张家界市永定区HIV-1 B亚型系统进化树分析，发现了8个明显的聚集簇簇内毒株基因的遗传距离和Bootstrap值的判断结果基本吻合，进一步印证了簇内感染个体间感染来源存在高度关联性。

聚集簇内感染者的流行病学调查结果显示，嫖娼为当地老年男性的主要感染途径。流行病学调查的结果指向，多名HIV感染者都到过地点A和B嫖娼，与实际情况A、B两地分布的暗娼点较密集相一致。有两个聚集簇簇内遗传距离为0.000 0，提示簇内的感染者来源于同一地点并被同一传染源感染。同时8个聚集簇内的19名调查对象，4名女性的传染来自配偶；13名男性中，3人将病毒传播给了自己的妻子，表明家庭内传播成为另一个重要途径。老年人丧偶、未婚、性生活不和谐、卖淫妇女引诱和同伴的影响是催生嫖娼的动因，无保护性行为则是感染HIV的主要因素^[19]。在当地老年人中，已经形成了嫖娼感染HIV和感染后家庭内传播两个传播途径。本研究发现的2例老年MSM HIV-1感染者具有高度同源性，提示对此类人群应该引起重视。

现阶段艾滋病防治工作中，主动发现HIV传染源的难度越来越大，部分感染者不愿意提供可能的感染场所，这为深入开展行为干预和溯源带来困难。上述研究表明，通过分子生物学技术与流行病学个案调查结合，可以很好地印证传染源的灶性分布，实现了在空间和人间的“精准”定位，对于研究毒株的传播链和开展针对性的定点干预有很好的指导意义并提供了一个新的工作思路。但是，该方法涉及分子生物学技术，对技术、时间和经济成本要求较高，加之HIV-1病毒变异性大，本研究样本量较少且仅分析了pol区序列，缺全序列分析，影响序列信息的精确性，对研究结果造成一定影响。随着分子生物学技术向快速、简便方向发展，将广泛用于流行病学领域。