A组链球菌(GAS)疾病谱比较广泛，可引起咽扁桃体炎、猩红热、皮肤感染，严重者还可引起侵袭性疾病如坏死性筋膜炎、链球菌感染中毒休克综合征以及风湿热、急性链球菌性肾小球肾炎等后遗症^[1-2]。超抗原是迄今为止发现的能力最强的T细胞丝裂原，浓度不超过0.1 pg/ml的细菌超抗原就能够刺激T淋巴细胞引发机体发热，休克甚至死亡^[2]。目前，在GAS中陆续发现的超抗原已达11种，分别是链球菌致热外毒素(streptococal pyrogenic exotoxis，spe) speA、speC、speG、speH、speI、speJ、speK、speL、speM、链球菌超抗原(streptococcal superantigen，ssa)、链球菌促有丝分裂外毒素(streptococcal mitogenic exotoxin Z，smeZ)^[3]。其中speG，speJ，speZ由细菌的染色体编码，其余则由细菌细胞内的噬菌体编码，且部分超抗原存在多个等位基因^[3]。speB和speF之前也曾被认为是超抗原家族的成员，但随后的研究证明这两种蛋白并不具备超抗原的促进淋巴细胞增殖特性^{[1, 3]}。GAS致病力与链球菌超抗原密切相关^[4-5]。超抗原谱在不同人群中、不同地区有较大差异，emm分型、PFGE和多位点序列分型等常用的检测方法无法反映出超抗原基因在细菌间的水平传播。超抗原分析可作为GAS检测方法的补充，进一步描述、鉴别GAS毒力是否增强、与特定感染是否相关等特征^[3]。为了解北京市GAS超抗原携带现状及变化趋势，并分析其与emm基因型别及临床表现的相关性，本研究对2015—2017年北京市猩红热及咽部感染患者中分离到的GAS菌株进行M蛋白基因(emm基因)分型和超抗原基因检测分析，为指导猩红热及咽部感染的防控工作提供科学依据。

材料与方法

1.材料：标本来源于2015—2017年北京市猩红热监测网络。该监测网络由北京市16个区级CDC实验室和对应哨点医院组成，各区选择辖区内1家报告猩红热患者数较多的医院儿科门诊/急诊开展猩红热监测。监测对象为哨点医院诊断为猩红热(疑似/临床诊断/实验室确诊)和(链球菌感染/扁桃体炎/咽峡炎)的病例，哨点医院每周采集本院报告的全部猩红热病例咽拭子标本和10份诊断为链球菌感染/扁桃体炎/咽峡炎的病例标本。采集的咽拭子浸入采样肉汤液中，在常温下2~4 h，最迟12 h送达对应的实验室进行检测。

2.实验室检测：

(1) GAS菌株分离及鉴定：每周实验室接到咽拭子标本后，全部标本立即开展GAS菌株的分离和鉴定。咽拭子标本于振荡器上充分振荡15~30 s，用接种环取1~2环处理过的咽拭子标本，划线接种于脱纤维羊血哥伦比亚血琼脂平板上。在37 ℃含5%CO2的恒温箱中孵育24 h。次日，观察菌落形态及溶血现象，挑选β溶血的灰白色、透明或不透明、表面光滑、圆形突起的小菌落进行纯培养。采用VITEK-2 COMPACT全自动细菌生化鉴定分析仪(法国生物梅里埃公司)进行生化鉴定，对生化符合的菌株用链球菌A~F分群鉴定试剂盒分群鉴定出A群。

(2) DNA提取：每年采用GAS基因提取试剂盒(上海之江生物科技有限公司)对当年分离到的全部GAS菌株进行DNA提取。用无菌接种环挑取经鉴定的GAS菌落若干，直接加入200 μl核酸抽提液，充分混匀，沸水浴10 min，13 000 r/min离心5 min，取上清。

(3) 超抗原基因检测：每年采用实时荧光PCR试剂盒(上海之江生物科技有限公司)对当年分离到的全部GAS菌株进行11种超抗原基因(speA、speC、speG、speH、speI，speJ、speK、speL、speM、smeZ、ssa)检测。PCR检测条件为94 ℃预变性2 min，93 ℃高温变性15 s，55 ℃低温退火60 s，共40个循环。单点荧光检测在55 ℃。荧光通道检测选择FAM和VIC/HEX通道。Ct值≤38确定为阳性。

(4) emm基因分型：采用美国CDC公布的方法，对当年分离到的全部GAS菌株进行emm分型。提取DNA，PCR产物纯化、测序后，将序列上传到美国CDC数据库进行emm基因序列比对，对菌株emm基因进行分型。

3.统计学分析：使用SPSS 19.0软件进行统计分析。研究对象构成比和超抗原基因携带率采用百分数表示，组间率和构成比的比较采用χ²检验或Fisher’s确切概率法。检验水准α＝0.05，双侧检验。

结果

1. GAS菌株及病例相关信息：在2015年5月至2017年7月采集诊断为猩红热病例的咽拭子标本603份，诊断为咽部感染病例6 151份，诊断信息不明47份，共6 801份。经实验室检测并分离到377株GAS菌株(分离阳性率为5.5%)，其中，猩红热病例的GAS菌株分离阳性率为19.9%(120/603)，咽部感染病例的阳性率为4.1%(252/6 151)，5个阳性菌株诊断信息缺失。2015—2017年，总的GAS菌株分离阳性率、猩红热病例和咽部感染患者的分离阳性率，2015年为5.1%(120/2 364)、14.2%(32/225)和4.1%(88/2 138)；2016年为5.4%(117/2 182)、23.6%(37/157)和3.8%(77/2 005)，其中3个菌株诊断信息缺失；2017年为6.2%(140/2 255)、23.1%(51/221)和4.3%(87/2 008)，其中2个菌株诊断信息缺失。GAS菌株分离阳性率在2015—2017年间的差异无统计学意义(χ²＝3.027，P＝0.220)。分离到377株GAS菌株的患者中，男性221例(58.6%)，女性150例(39.8%)，6例缺失性别信息；年龄M＝6(1~32)岁。学龄前儿童(＜7岁)208例(55.2%)，学龄期儿童(7~18岁)164例(43.5%)，青年人1例(0.3%)，4例年龄信息缺失。3年间各年龄组构成差异无统计学意义(Fisher’s值＝2.522，P＝0.709)。对377株GAS菌株进行超抗原基因和emm基因检测，结果显示，emm1型163株(43.5%)，emm12型198株(52.8%)，其他型别14株(3.7%)，2例信息缺失。3年间emm基因型构成差异无统计学意义(χ²＝0.410，P＝0.979)。

2. GAS超抗原基因分布情况及变化趋势：377株GAS菌株中，超抗原基因smeZ(99.7%，376/377)、speG(97.6%，368/377)、speC(96.3%，363/377)和ssa(74.3%，280/377)的检出率较高，而speK(4.8%，18/377)、speM(0.8%，3/377)和speL(0.5%，2/377)的检出率较低(表 1)。3年间speC、speG、speH和speK的检出率的出现较明显变化(Fisher，P＜0.001；Fisher，P＝0.004；χ²＝9.099，P＝0.011；χ²＝34.225，P＜0.001)，speC、和speH检出率在不断降低，speG的检出率先升高后又降低，而speK的检出率先降低后又有所回升(表 1)。

3. GAS超抗原基因谱分布情况：携带4~7个超抗原基因的菌株所占比例较高，仅4.2%(16/377)的菌株携带的超抗原基因≤3个，1.1%(4/377)的菌株≥8个。共检测到45种超抗原基因谱，分别命名为profile1~45，其中主要的8种基因谱编号分别为profile1~8(表 2)。携带profile1和profile2的菌株所占比例最高，分别为24.7%(93/377)和24.4%(92/377)，其他基因谱所占比例均≤7.2%。profile1携带的超抗原为speC、speG、speH、speI、smeZ和ssa，profile2携带的超抗原为speA、speC、speG、speJ、smeZ和ssa(表 2)。

致猩红热菌株中，30.0%(36/120)携带profile1，27.5%(33/120)携带profile2，与致咽部感染菌株中携带profile1(22.6%，57/252)或profile2(23.0%，58/252)的比例相比，差异均无统计学意义(profile1：30.0%比22.6%，χ²＝2.362，P＞0.05；profile2：27.5%比23.0%，χ²＝0.885，P＞0.05)(表 2)。

emm1基因型菌株携带profile1的比例(15/163)低于emm12基因型菌株携带profile1的比例(74/198)(9.2% vs. 37.4%；χ²＝38.196，P＜0.001)；而emm1基因型菌株携带profile2的比例(76/163)高于emm12基因型菌株携带profile2的比例(15/198)(46.6% vs. 7.6%；χ²＝72.310，P＜0.001)(表 2)。

4.不同emm分型、不同临床特征病例(猩红热、咽部感染)病例GAS超抗原携带情况：在emm1型与emm12型菌株之间，携带speA、speH、speI和speJ基因的比例有差异(χ²＝146.154，P＜0.001；χ²＝52.31，P＜0.001；χ²＝58.43，P＜0.001；χ²＝144.70，P＜0.001)。emm1型携带speA和speJ基因的比例高达79.8%(130/163)、82.2%(134/163)，而emm12型仅为16.2%(32/198)和18.7%(37/198)；emm1型携带speH和speI基因的比例仅为24.5%(40/163)、11.7%(19/163)，而emm12型较高，达到62.6%(124/198)和49.5%(98/198)(表 1)。在致咽部感染和致猩红热菌株之间，携带超抗原基因的比例差异均无统计学意义(P＞0.05)(表 3)。

讨论

人类对链球菌及相关疾病的认识已有数百年的时间，然而近些年来由于禽流感^[6]、黄热病^[7]、寨卡病毒病^[8]等新发传染病引起公众较大关注，而对于链球菌引起的猩红热、咽部感染等疾病的重视不够。GAS依然是引起儿童感染性疾病的重要致病菌，具有广泛的疾病谱^[9]，而对GAS超抗原的研究可以为相关疾病的治疗和预防提供重要的信息。

本研究发现超抗原基因smeZ、speG、speC和ssa的检出率较高，而speK、speM和speL的检出率较低。检出率与国内一些地区GAS菌株超抗原基因构成一致，但也有个别超抗原基因检出率存在一定或较大差异^[9-13]，如与马耀玲等^[9]研究相比，speH、speI和ssa的检出率降低达17%以上，与刘贞艳等^[13]研究相比，speI的检出率下降达21%以上。可能原因有4个方面：①方法学原因。超抗原基因存在多个等位基因，探针不能扩增所有等位基因，导致假阴性报告^[3-4]。②研究对象的差异。各研究纳入研究对象的临床表现、年龄组有所差异，不同人群中GAS菌株的基因特征可能存在差异^[3]。③研究地点不同。各个城市流行的GAS菌株基因特征存在差异^[3]。④研究时间不同。不同年份同一地点流行的GAS菌株超抗原基因谱随时间发生变化^[14]。

smeZ和speG是由染色体基因编码^{[1, 3]}，本研究中smeZ和speG检出率较高，与马耀玲等^[9]的研究结果相近，高于国外部分研究^{[1, 3]}。检测到的11种emm基因分型中，均携带smeZ，而speG仅在emm241基因型中缺失。相对而言，speJ也被认为由染色体基因编码^[1]，但speJ的检出率＜50%，远小于上述两种由染色体基因编码的超抗原，且仅在6种emm基因型中有检出，该结果与Meisal等^[15]和Commons等^[16]的研究结果一致，高于Berman等^[17]的研究。原因可能为speJ基因从温和噬菌体获得，但在基因组传代过程中丢失，导致检出率低，但也不排除其他原因的可能^[4]。

噬菌体编码的超抗原中，speC检出率最高，其次为ssa，明显高于Meisal等^[15]、Commons等^[16]和Berman等^[17]的研究结果。其他由噬菌体编码的超抗原基因中，speH、speA和speI检出率较高，而speK、speM和speL的检出率较低，与Meisal等^[15]和Commons等^[16]的研究结果一致，高于Berman等^[17]的研究结果，但检出率略有差别。有研究显示^[18]，speM和speL位于前噬菌体同一位点上，总在同一毒株中被检出，由于本研究中检出率极低，无法进行比较。研究表明，speH和speI位于同一噬菌体上^[19]，基因高度的一致，但本研究中携带speH的GAS中，65.7%的菌株同时携带speI，一致性低于既往研究^[5]，原因可能为speI在噬菌体整合过程中丢失，或存在一种只携带speH的噬菌体^[16]。speA和speC为最早发现的超抗原基因，可编码致热外毒素引起致热反应和皮肤红斑反应。本研究显示，emm1型对speA基因的携带率明显高于emm12型，但emm1型对speC基因的携带率与emm12型相比没有差异，与本研究组3次在北京开展的研究结果一致^{[5, 10-11]}。

目前，超抗原与GAS感染后所表现的临床症状需要进一步研究。本研究所检测的11种超抗原中，均未发现在致猩红热和致咽部感染菌株间的分布存在差异。但GAS导致的疾病及相应的临床表现比较广泛^{[1, 20]}，导致除猩红热和咽部感染以外其他疾病的GAS菌株间的分布是否存在差异仍需进一步研究。检测到的45种超抗原基因谱中，基因谱profile1、profile2所占比例高于49%。与本研究组3次研究结果相比^{[5, 10-11]}，除2014年外，超抗原基因谱种类不断增加，占比最高的两种谱，所占比例有所降低，但谱的构成未发生变化，基因谱profile1、profile2分别在emm12型、emm1型GAS中最常见这一特点也未发生变化。该结果表明，北京市致猩红热和致咽部感染的GAS菌株所携带的超抗原基因谱更宽，但主要流行谱未发生改变。占比最高的超抗原基因谱与北京地区开展的研究一致^[21]，与国外研究差异明显^{[3, 15, 17]}，可能原因之一为GAS菌株的时间、地点来源不同导致基因特征存在差异，其二为患者性质不同，国外一些研究纳入了侵袭性感染患者。

综上所述，对北京市猩红热患者和咽部感染患者分离出的GAS菌株进行超抗原分析发现，11种超抗原基因中smeZ、speG、speC、ssa检出率较高，而speK、speM、speL检出率较低，2015—2017年超抗原基因speC、speG、speH和speK的检出率有较明显变化。speA、speH、speI和speJ在emm1和emm12基因型之间的分布存在差异；11种超抗原均未发现在致猩红热和咽部感染菌株间的分布存在差异。GAS菌株所携带的超抗原基因谱变得更宽，但主要流行谱未发生改变。

利益冲突: 无