弯曲菌的感染可导致弯曲菌病（campylobacteriosis）。弯曲菌病主要表现为腹泻、发热、呕吐、恶心等临床症状^[1-2]。感染可导致弯曲菌病的主要菌种为空肠弯曲菌（C. jejuni）、结肠弯曲菌（C. coli）、海鸥弯曲菌（C. lari）和乌普萨拉弯曲菌（C. upsaliensis）。除肠炎外，C. jejuni的感染还可能导致人罹患格林-巴利综合征^[3]。

2004－2012年，美国报道弯曲菌病（基于细菌培养）年平均发病率为11.4/10万；共有347起暴发事件报道，数量有逐年增长趋势并且分离株对环丙沙星的耐药率出现增高^[4]。2000年后由于我国样本中细菌耐药性增强，使应用选择性培养基进行弯曲菌的体外分离培养越来越困难，腹泻病例弯曲菌检出率处于较低水平^[5-6]。2016年开始弯曲菌过滤培养法在全国普遍推广，腹泻病例中弯曲菌检出率显著提升^[7-8]。2018年北京市顺义区和西城区首次识别了我国由C. coli和C. jejuni感染导致的急性胃肠炎的暴发事件^[9-10]。无论是散发还是暴发，弯曲菌的分离株均提示中国地区弯曲菌耐药情况严重。本研究针对2019年8月发生在北京市通州区一起急性胃肠炎暴发事件，通过病例粪便核酸检测以及病原菌的分离培养确定该事件可能由于C. jejuni感染所导致。本研究为我国弯曲菌导致暴发事件的实验室检测与病原分析提供经验。

材料与方法 (1) 材料

（1）暴发相关病例信息及标本采集：本起事件中病例均为某培训学校艺考学生。病例均多日在学校连续就餐，食谱中均出现过炖鸡腿和宫保鸡丁。事件中采集到样本包括病例粪便4件（YQ07~YQ10）、学校食堂厨房盛菜盆、水龙头、案板、菜刀涂抹4件（YQ01~YQ04）以及2名厨师粪便样本（YQ05~YQ06）；鉴于病例均食用过炖鸡腿和宫保鸡丁，因此对该学校食堂中的生鸡原材料进行了采集：包括2份鸡腿（SP1~SP2）、1份鸡胗（SP3）和1份鸡胸脯（SP4）样本。样本采集后4 ℃保存，2 h内运送至区CDC开展病原检测。样本采集和运输均符合无菌要求。

（2）仪器与试剂：粪便标本弯曲菌检测试剂盒（ZC-CAMPY-001，青岛中创生物科技有限公司）；胰酪蛋白胨大豆肉汤（北京陆桥技术股份有限公司）；弯曲菌琼脂稀释法抗生素最低抑菌浓度（MIC）检测试剂盒（ZC-AST-001，青岛中创生物科技有限公司）；弯曲菌生化鉴定试剂盒（ZC-CAMPY-010，青岛中创生物科技有限公司）；微需氧袋（日本三菱MGC）；细菌全基因组提取试剂盒（北京陆桥生物制品有限公司）；沙门菌、志贺菌、C. jejuni、C. coli、5种致泻大肠埃希菌、副溶血弧菌和诺如病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒（青岛中创生物科技有限公司、卓成惠生生物科技有限公司）；Lightcyclerzz^® 480Ⅱ荧光定量PCR仪（德国Roche）；所有试剂均在有效期内使用。

(2) 方法

（1）粪便标本病原核酸检测：用200 mg粪便提取核酸，核酸提取方法参照核酸提取试剂盒说明书。针对提取的核酸进行诺如病毒、C. jejuni、C. coli、志贺菌、沙门菌、5种致泻大肠埃希菌、副溶血弧菌7种重要食源性病原的实时荧光PCR筛查。检测方法均参照相应试剂盒说明书。

（2）病原菌的分离培养及鉴定：C. jejuni、C. coli的分离培养参照文献中的方法^{[7, 11]}，沙门菌、志贺菌、致泻大肠埃希菌、副溶血弧菌也同时进行分离培养；检测标准参照文献[12-13]中的检测方法。

（3）PFGE检测：对病例及生鸡原材料样本中分离弯曲菌进行PFGE分子分型检测^[2]，限制性内切酶选用SmaⅠ，酶切时间为6 h，电泳条件6.76~35.38 s，电泳时间18 h；分子量标准为沙门菌H9812，其限制性内切酶选用XbaⅠ；指纹图谱使用Bionumerics 5.1软件进行聚类分析。

（4）病例分离C. jejuni耐药性检测：使用琼脂稀释法进行7类11种抗生素耐药检测，根据NARMS于2015年释放的弯曲菌耐药折点标准（http://ars.usda.gov/Main/docs.htm?docid＝6750）判定敏感和耐药结果，各抗生素耐药判定折点值为：红霉素（ERY）（≥32 μg/ml）、阿奇霉素（AZI）（≥8 μg/ml）、萘啶酸（NAL）（≥64 μg/ml）、环丙沙星（CIP）（≥4 μg/ml）、庆大霉素（GEN）（≥8 μg/ml）、链霉素（STR）（≥16 μg/ml）、氯霉素（CHL）（≥32 μg/ml）、氟苯尼考（FLO）（≥8 μg/ml）、四环素（TET）（≥16 μg/ml）、替考拉宁（TEL）（≥16 μg/ml）、克林霉素（CLI）（≥8 μg/ml）。检测方法按照试剂盒说明书进行。

（5）菌株基因组测序及遗传特征分析：应用细菌全基因组提取试剂盒（北京陆桥生物制品有限公司）提取细菌全基因组DNA后送公司测序；测序由中国科学院微生物所（IMCAS）应用Illumina HiSeq X Ten完成；序列结果使用Fastqc软件进行质量检测，并应用Trimmomatic去除接头和低质量的序列，使用SPAdes 3.12和Abyss软件进行序列组装后进行基因组水平的遗传特征分析^[14-17]。

结果

1.病例特征分析：本次事件共涉及7例病例，其中男性4例，女性3例，年龄17~18岁，居住在学校的3间宿舍。见表 1。主要表现为发热（7/7）、腹痛（7/7）、腹泻（6/7）、头晕头痛（2/7）、呕吐（1/7）；7例中6例发热超过38.5 ℃，最高体温为39.4 ℃。

2.病原检测结果：4例病例粪便样本使用两种品牌试剂盒实时荧光定量PCR检测C. jejuni结果均为阳性；其中1件粪便样本培养出C. jejuni（菌株编号：TZ2019293）。4例病例粪便核酸使用两种品牌试剂盒检测诺如病毒、C. coli、志贺菌、沙门菌、5种致泻大肠埃希菌、副溶血弧菌核酸结果均为阴性；同时4例病例粪便样本C. coli、志贺菌、沙门菌、5种致泻大肠埃希菌、副溶血弧菌分离培养结果均为阴性。4件环境涂抹和2名厨师粪便样本诺如病毒、C. jejuni、C. coli、志贺菌、沙门菌、5种致泻大肠埃希菌、副溶血弧菌核酸检测结果及致病菌分离培养结果均为阴性。从食堂采集的4份生鸡原材料样本均分离到弯曲菌，挑取其中19个单克隆鉴定，其中12个单克隆为C. jejuni，7个单克隆为C. coli。

3.弯曲菌PFGE分型结果：对从生鸡原材料中分离的弯曲菌单克隆（C. jejuni和C. coli）和病例分离C. jejuni株进行PFGE分子分型检测，8个分别分离自鸡腿1和鸡腿2的C. jejuni单克隆PFGE带型成簇，4个分离自鸡胸脯（同1个样本）的C. jejuni克隆聚集成簇，病例分离C. jejuni株与鸡原材料中的分离C. jejuni株未成簇，见图 1；5个分离自鸡胗（同1个样本）的C. coli克隆聚集成簇，且与分离自鸡胸脯的1个C. coli克隆和分离自鸡腿2中的1个C. coli克隆未成簇，见图 2。

4.病例C. jejuni分离株抗生素敏感性检测和基因组测序结果：病例C. jejuni株7类11种抗生素耐药判定标准（MIC）值和耐药（R）、敏感（S）判定结果分别为ERY（1 μg/ml，S）、AZI（≤0.5 μg/ml，S）、NAL（＞64 μg/ml，R）、CIP（＞64 μg/ml，R）、GEN（≤0.5 μg/ml，S）、STR（1 μg/ml，S）、CHL（16 μg/ml，R）、FLO（16 μg/ml，R）、TET（16 μg/ml，R）、TEL（2 μg/ml，S）、CLI（1 μg/ml，S）；为多重耐药菌株。

病例C. jejuni株的全基因组测序结果中共含26个contigs，基因组大小约为1 657 903 bp，GC含量为30.43%，共预测到1 699个CDS。基因组测序结果分析确定该菌株为ST10075型。通过耐药数据库的筛查发现测序菌株含有cmeABCR、tetO/M和blaOXA-61耐药相关遗传元件，菌株23S rRNA的2 074和2 075位点均未发生突变，而gyrA基因的257位点发生了C-T的突变。

讨论

弯曲菌是重要的食源性疾病暴发致病菌^[18]。自2016年弯曲菌增强过滤法得到推广应用后，张新等^[10]于2018年首次在我国报道一起C. jejuni导致的腹泻疫情暴发。2018年北京市顺义区也识别一起由于C. coli感染导致的急性胃肠炎的暴发^[9]。

本次事件流行病学调查资料显示病例有共同就餐史，且4例病例C. jejuni核酸检测皆为阳性，并且1例病例的标本中分离到C. jejuni株，其他检测的食源性病原皆为阴性。实验室检测结果表明此次暴发很可能是由于C. jejuni感染导致。

本研究中，虽然有标本的病例C. jejuni的核酸检测皆为阳性，但是只有1例病例分离到C. jejuni株，这与标本的质量可能有关，比如样本采集的时间，尤其标本中“活”的病原菌的量有关。调查发现4例病例中，3例曾服用过硫酸依替米星（氨基糖苷类抗生素）的病例仅C. jejuni核酸阳性，未能成功分离C. jejuni株；仅未服用抗生素的1例病例成功分离C. jejuni株；耐药检测结果显示该菌株对庆大霉素、链霉素（氨基糖苷类抗生素）敏感，提示3例C. jejuni核酸检测阳性但分离培养阴性的病例有可能因服用抗生素而造成分离培养失败。

本起事件中7例病例主重要临床症状为发热和脐周腹痛，其中6例病例均出现＞38.5 ℃的高热，最高发热温度达到39.4 ℃，这与2018年发生在北京市顺义区一起C. coli导致的暴发事件中3例病例均出现高热症状相似^[9]。发热症状是否是弯曲菌感染相关暴发事件的特征需要更多研究进一步证实。测序菌株gyrA基因257位点发生了C-T突变（喹诺酮类耐药机制）、携带tetO/M基因（四环素耐药机制）与其对萘啶酸（喹诺酮类）、环丙沙星（氟喹诺酮类）、四环素耐药的表型检测结果相符合；C. jejuni分离株23S rRNA的2 074和2 075位点均未发生突变（大环内酯类耐药机制）与其对大环内酯类抗生素（红霉素、阿奇霉素）敏感的表型结果相符合。本次分离C. jejuni株为ST10075，与pubMLST中仅有一株同ST型菌株（分离自美国）具有较好的共线匹配度。由于本次暴发现场未能采集到可疑污染食品，厨师粪便弯曲菌核酸检测结果和分离培养结果以及环境拭子弯曲菌培养结果均为阴性，因此采集了该食堂生鸡原材料样本，并尝试通过弯曲菌分离培养和PFGE分子分型试验进行溯源。研究发现4件生鸡原材料均污染了弯曲菌，虽然分离株呈现多种PFGE带型，且与病例分离株PFGE带型并不一致，但发现2件样本存在C. jejuni和C. coli混合污染的情况，说明食品原材料中存在较严重的弯曲菌的污染，病例分离株可能是食用的食品中污染了不同克隆的菌落，也可能是食品的交叉污染导致。有文献报道北京地区生鸡样本弯曲菌污染率高达75%^[11]，生鸡原材料中弯曲菌污染普遍存在，菌株分子特征呈分散分布^[11]，这些原因可能也是此次原材料分离株和病例株溯源失败的原因；同时说明食品加工过程中存在较高弯曲菌交叉污染的风险，集中餐饮单位应加强生熟食品加工的规范化操作，降低食源性弯曲菌感染风险。

综上所述，弯曲菌在我国极有可能因实验室应对能力不足而低估其作为食源性暴发病原的重要程度，实验室应加强暴发事件中弯曲菌分子筛查、分离培养及病原分析能力，有效应对暴发事件，评估暴发风险，指导临床治疗。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突