HIV耐药株产生后，会传播到新感染人群^[1]，感染者携带HIV耐药株，导致以后的抗病毒治疗困难。耐药警戒线调查是通过对未接受抗病毒治疗的HIV感染者进行HIV耐药检测，判断耐药株的传播水平，为采取相应的防治措施提供科学依据^[2]。德宏州为云南省艾滋病高流行地区之一，截至2012年底，累计报告HIV感染者及AIDS患者（HIV/AIDS）超过15 000人，占云南省的16.0%，累计抗病毒治疗6 614人，占云南省的16.9%。为评价德宏州HIV-1基因型及耐药株的流行情况，保证抗病毒治疗的可持续性和科学性，开展了德宏州HIV-1基因型及耐药警戒线调查。 对象与方法

1. 研究对象及样本来源：按照《全国艾滋病病毒耐药性监测指南》中耐药警戒线调查的要求，2013年1－8月，在云南省德宏州连续收集16～25岁HIV新报告感染者血浆样品，排除不满足要求的样本后获得54份血浆样品。调查对象均签署知情同意书。排除标准：①以前有HIV阳性检测记录；②以前接受过抗病毒治疗；③有WHO规定的Ⅲ期或Ⅳ期临床症状；④CD4＋T淋巴细胞计数＜200 cells/μl。

2. 实验室检测：①HIV-1 RNA的提取：使用Qiagen公司QIAamp Viral RNA 试剂盒，根据标准操作程序从140 μl样品中提取HIV-1病毒RNA。②巢式PCR扩增pol基因区：使用TaKaRa公司One Step RNA PCR Kit（AMV）试剂盒，进行反转录及第1轮PCR扩增，反应总体系25 μl，引物为MAW26和RT21（表 1）。使用Tiangen公司2×Taq PCR MasterMix试剂盒，进行第2轮PCR扩增反应，反应体系50 μl，引物为PRO-1和RT20（表 1）。扩增产物长度为1.3 kb，包括蛋白酶（protease，PR）基因全长（1～99密码子）和反转录酶（reverse transcriptase，RT）基因1～300密码子。③PCR扩增产物电泳鉴定和测序：使用1%琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物条带，阳性样本送北京梓熙生物科技公司纯化和测序。测序采用3个正向测序引物PROS3、RTAS、RTB和2个反向测序引物PROC1S、RT20S3（表 1）。

表 1 扩增及测序引物

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3. 序列分析：使用Gene Codes公司的Sequencher 5.0软件进行序列拼接，Bioedit软件进行多序列比对和序列整理。用Mega 5.1软件构建Neighor-joining（NJ）系统进化树，重复运算1 000次进行分型验证。所得序列利用HIV耐药数据库（hivdb.stanford.edu）的校正群体耐药分析工具[the calibrated population resistance （CPR） tool]在线贴网分析^[3]，监测耐药突变（Surveillance Drug Resistance Mutations，SDRM）列表^[4]，确定耐药突变位点和对各种抗病毒药物的耐受程度。

4. 耐药株传播水平分析：根据WHO的HIV耐药警戒线调查方案，采用截断顺序抽样法（truncated sequential sampling，TSS）进行抽样^[2]，并结合“耐药警戒线监测抽样表”进行耐药株传播水平分析。传播水平分为低传播水平（＜5%）、中度传播水平（5%～15%）和高度传播水平（＞15%）。

5. 统计学分析：应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，率的比较采用χ2检验。出现理论频数＜5时，采用Fisher精确χ2检验。 结 果

1. PCR扩增及测序：2013年1－8月，在德宏州收集16～25岁HIV-1感染者血浆样品70份，排除继往阳性后，新报告的HIV-1感染者的样品有64份，其中6份样品无CD4＋T淋巴细胞检测结果，4份样品CD4＋T淋巴细胞计数＜200 cells/μl。最终符合耐药警戒线调查标准的样品为54份。经扩增和测序，48份样品获得可分析的pol区序列，满足耐药警戒线统计分析的要求。

48例感染者中，男女比例为1 ∶ 1.29，年龄为16～24岁，M＝22岁。传播途径以异性传播为主，占77.1%（37/48），注射吸毒传播占16.7%（8/48），同性传播占6.3%（3/48）。在异性传播中，83.8%（31/37）有非婚异性性接触史，16.2%（6/37）是婚内阳性配偶/固定性伴感染。民族分布：景颇族35.4%（17/48）、汉族33.3%（16/48）、傣族25.0%（12/48）和德昂族6.3%（3/48）。职业以农民为主，占72.9%（35/48），其他职业占27.1%。研究对象中国籍者占45.8%（22/48），缅甸籍者占54.2%（26/48）。不同国籍感染者的传播途径构成上存在差异（表 2）。

表 2 不同国籍HIV-1感染者感染途径的分布

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2. 基因型分布：利用pol区序列进行分型，C亚型占41.7%（20/48），URF占31.3%（15/48），CRF01_AE占12.5%（6/48），CRF07_BC占10.4%（5/48），CRF08_BC占2.1%（1/48）和B亚型占2.1%（1/48）。检测到的URF中BC重组占86.7%（13/15）、CRF01_AE/C重组占6.7%（1/15）和CRF01_AE/B/C重组占6.7%（1/15）。研究对象的基因型在异性传播和注射吸毒传播间差异无统计学意义，但在中国籍和缅甸籍感染者间差异有统计学意义，中国籍感染者中首位的基因型是C亚型，缅甸籍感染者中首位的基因型是URF（表 3）。

表 3 不同传播途径和地区类别的研究对象基因型分布

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3. 耐药相关突变和耐药株的流行率：48例样品中，有1例缅籍感染者样本检测到携带针对非核苷类反转录酶抑制剂（NNRTI）耐药传播相关的突变位点（SDRM），为K103N。其传播途径为注射吸毒，基因型为BC，耐药情况为H：DLV EFV NVP（根据WHO 2009版SDRM耐药突变位点分析，H为高度耐药）。

根据耐药警戒线调查的统计方法，将获得的序列按采样时间排序，第14个序列携带SDRM，计算累计耐药样品数并填入《耐药警戒线监测抽样表》（表 4），当样本量达到44时，耐药样品累计数小于下限，停止抽样，可判断为HIV-1耐药株的低度流行水平（＜5%）。

表 4 耐药传播警戒线调查的抽样方法和传播水平划分方法

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抗病毒治疗人群的耐药监测能够揭示HIV耐药发生、发展趋势以及影响因素，新近感染人群的耐药监测，可提供HIV耐药株分布和流行状况，为制定减少HIV耐药株传播的措施提供科学依据，指导制定一线抗病毒治疗方案。德宏州是云南省艾滋病流行时间较长的地区，也是云南省艾滋病防治的重点地区。依据WHO耐药警戒线调查的方法^[2]，德宏州从2009年起开展了耐药传播的调查工作^{[5, 6, 7, 8]}，一方面可评价当地的抗病毒治疗工作，另一方面可为其他地区提供借鉴，以便科学地开展艾滋病治疗工作。

近年来德宏州的艾滋病防治工作初见成效。德宏州总人口数为121.1万，在HIV筛查人数大幅增加的前提下，报告的感染者人数出现下降。其中，中国籍的感染者人数下降显著，缅甸籍的感染者人数则在增加：2010年德宏州筛查20.2万人次，新报告感染者1 282人，其中缅甸籍366人，占28.5%；2011年筛查48.3万人次，新报告感染者1 525人，其中缅甸籍595人，占39.0%；2012年筛查71.1万人次，新报告感染者1 341人，其中缅甸籍661人，占49.3%。本次调查的样本中，缅甸籍的感染者占54.2%，呈增高趋势，提示当地艾滋病防治工作呈现了新的方向。本次调查发现男女比率为1 ∶ 1.29，主要是因为缅甸籍感染者中女性比例较高，中国籍感染者中男女比例为1 ∶ 0.69，而缅籍感染者中男女比例为1 ∶ 2.25。18名缅籍女性感染者中，77.8%有非婚异性性接触史，22.2%的配偶/固定性伴HIV阳性。由于涉外婚姻和跨境买淫的存在，使得缅籍女性成为需要关注的重点人群。

本次调查结果提示C亚型和URF为德宏地区的主要HIV-1基因型，和以往调查结果类似^{[7, 8]}。但中国籍和缅甸籍感染者的HIV-1基因型分布有差异，缅甸籍感染者中URF的比例高于中国籍感染者，耐药株也是在缅甸籍感染者中发现的，提示缅籍感染者中存在着复杂的传播关系，需要加强外籍人员的艾滋病综合防治工作。

在本次调查中，检测到了1个针对NNTRI的耐药突变位点：K103N。根据往年的调查，在2011年和2012年新报告的HIV-1感染者中都检测到了携带该位点耐药毒株^{[6, 8]}，并且在德宏州抗病毒治疗1年以上病毒载量超过1 000 copies/ml的患者中，K103N的检出率达39%（27/69），是首位的NNRTIs耐药突变位点^{[9, 10]}。提示携带该耐药位点的毒株可能来源于治疗人群，并在当地形成了传播。德宏州累计治疗缅甸籍615人，在治456人，其中跨境婚姻232人，目前暂未针对接受抗病毒治疗的缅籍人员开展耐药专项调查，今后需开展此方面的调查。

根据警戒线的判别方法，本次调查提示德宏州耐药株的流行率尚属于低度水平，与既往调查结果类似^{[5, 6, 8]}（自2009年开展调查以来，德宏的耐药株流行率处于中度或低度流行水平），与云南省其他艾滋病流行重点地区（昆明、红河、文山、临沧）耐药株处于低流行水平一致^{[11, 12, 13, 14, 15]}，说明云南省HIV耐药株尚处于中低度流行水平，但随着抗病毒治疗覆盖率的不断提高，需持续开展耐药株警戒线调查。

从治疗患者耐药发生的情况来看，HIV病毒载量在1 000 copies/ml以上的艾滋病患者中HIV耐药株检出率较高^[10]。因此控制耐药株传播的关键，是进一步加强抗病毒治疗人群的规范治疗及科学管理，同时有效干预以降低危险行为，减少新发感染。为全面了解耐药传播的情况，需连续开展耐药监测。德宏州与缅甸接壤，无天然屏障，边民来往频繁，通婚现象普遍，1989年云南省首次发现HIV感染者为德宏当地吸毒者与缅籍人员共用针具而感染。20多年来，HIV一直在中国籍与缅甸籍人员间相互传播，除了耐药警戒线的调查外，还需要考虑在缅甸籍感染者中开展专项调查，以评估耐药株流入对当地大规模公共卫生模式抗病毒治疗工作的影响。